1、檢測目的:
本試劑盒用于測定大鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中多聚ADP核糖聚合酶-1（PARP-1）活性。
2、實驗原理：
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中大鼠多聚ADP核糖聚合酶-1（PARP-1）水平。用純化的大鼠多聚ADP核糖聚合酶-1（PARP-1）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入多聚ADP核糖聚合酶-1（PARP-1），再與HRP標記的多聚ADP核糖聚合酶-1（PARP-1）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的多聚ADP核糖聚合酶-1（PARP-1）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中大鼠多聚ADP核糖聚合酶-1（PARP-1）活性。
3、試劑盒組成：
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試劑盒組成 |
48孔配置 |
96孔配置 |
保存 |
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說明書 |
1份 |
1份 |
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封板膜 |
2片 |
2片 |
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密封袋 |
1個 |
1個 |
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酶標包被板 |
1×48 |
1×96 |
2-8℃保存 |
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標準品 （64IU/L） |
0.5ml×1管 |
0.5ml×1管 |
2-8℃保存 |
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酶標試劑 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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樣品稀釋液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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標準品稀釋液 |
1.5 ml×1瓶 |
1.5 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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顯色劑A液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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顯色劑B液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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終止液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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濃縮洗滌液 |
20倍20ml×1瓶 |
30倍20ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
4、樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?/font>2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高于標準品的最高值，請將樣品做適當倍數(shù)稀釋后檢測，建議正式實驗前做預(yù)實驗以確定稀釋倍數(shù)。
5、自備實驗器材（不提供，可代購）：
1.酶標儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2.高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3.洗板機或洗瓶
4.37℃孵育箱
5.雙蒸水，去離子水，量筒等
6.稀釋用聚丙烯試管
6、操作步驟：
1. 
標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。
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32IU/L |
5號標準品 |
150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液 |
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16IU/L |
4號標準品 |
150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
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8IU/L |
3號標準品 |
150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
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4IU/L |
2號標準品 |
150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
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2IU/L |
1號標準品 |
150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液 |
2.
加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。
5. 
洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
6. 
加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7. 
溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
8. 
洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
9. 
顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘。
10. 
終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 
測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。
7、注意事項：
1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2.濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3.各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4.請每次測定的同時做標準曲線，最好做復(fù)孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
5.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6.底物請避光保存。
7.嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8.所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9.本試劑不同批號組分不得混用。
8、計算數(shù)據(jù)：
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
9、保存條件及有效期：
試劑盒保存： 2-8℃。
有效期： 6個月。
10、常見問題及解決方法：
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問題 |
可能原因 |
解決方法 |
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高背景或陰性對照值偏高 |
洗板不充分 |
將洗滌液注入反應(yīng)孔充分洗滌，徹底拍干孔中液體 |
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酶結(jié)合物過量 |
檢查酶稀釋度，按說明書標識的稀釋度稀釋 |
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底物污染 |
加底物前檢查底物是否為透明無色，請勿用變藍的底物，重新用新的底物試驗 |
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陰性對照孔被陽性對照污染 |
注意洗滌時不要把洗液溢出孔外，不使陰陽對照孔液體漣接一起 |
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不同批次試劑混用 |
檢查試劑批號，請勿用不同批次試劑 |
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顯色信號弱 |
試劑過期 |
檢查試劑盒有效期，請勿用過期試劑 |
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孵育時間過短 |
按說明書中規(guī)定的時間孵育 |
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試劑污染 |
檢查試劑是否污染，請勿用污染的試劑 |
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酶標儀濾光片不匹配 |
檢查酶標儀設(shè)置及濾光片是否匹配 |
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試劑盒平衡不充分 |
確保試劑盒試驗前平衡至室溫 |
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顯色時間不夠 |
增加底物顯色時間 |
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無顯色信號 |
檢測抗體、酶、或顯色劑漏加 |
檢查試驗操作流程，重復(fù)試驗 |
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酶被污染 |
請使用重新配制的試劑 |
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試劑添加順序有誤 |
檢查復(fù)核試驗添加順序、流程，重復(fù)試驗 |
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標曲佳但樣品孔無信號 |
樣品中靶標物含量低或樣品中無靶標物 |
設(shè)置陽性對照，重復(fù)實驗 |
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樣品基質(zhì)效應(yīng)影響檢測 |
重新稀釋樣品后復(fù)測 |
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標曲佳但樣品信號偏高 |
樣品中待檢物含量超過標準曲線范圍 |
重新稀釋樣品后復(fù)測 |
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邊緣效應(yīng) |
孵育溫度不均衡 |
孵育時每步均使用新的封板膠紙，避免在環(huán)境溫度變化大的地方孵育，勿疊放反應(yīng)板 |
掃描二維碼
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資料/datasheet
