兔原代細(xì)胞怎么提取
分離兔組織中原代細(xì)胞，一般采用組織塊貼壁法或者酶消化法。就拿兔腎皮質(zhì)來(lái)講，先把新鮮組織剪成1mm3小塊，接著用0.1%Ⅰ型膠原酶于37℃進(jìn)行40分鐘的消化，在這期間每隔10分鐘要輕輕搖晃一次。消化完畢后通過(guò)100目細(xì)胞篩過(guò)濾，再經(jīng)離心收集，這樣就能得到活性不錯(cuò)的腎小管上皮細(xì)胞。整個(gè)這個(gè)過(guò)程需要在超凈工作臺(tái)去完成，所有的器械要提前進(jìn)行滅菌，以此來(lái)避免細(xì)菌以及真菌的污染。
適合兔肝細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞等松散組織的是酶消化法，而皮膚和軟骨更適宜組織塊法。要注意控制消化時(shí)間，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)損傷細(xì)胞膜，時(shí)間過(guò)短則分離不徹底。首次進(jìn)行操作時(shí)建議先做預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)用臺(tái)盼藍(lán)染色來(lái)評(píng)估細(xì)胞活率，要確?；盥蔬_(dá)到85%以上之后再展開(kāi)后續(xù)培養(yǎng)。提取后的細(xì)胞需要盡快接種到預(yù)先已包被多聚賴(lài)氨酸的培養(yǎng)瓶中。
兔原代細(xì)胞培養(yǎng)注意什么
選擇培養(yǎng)基，會(huì)直接對(duì)細(xì)胞貼壁以及增殖效率產(chǎn)生影響，兔原代成纖維細(xì)胞呢，則以常用的DMEM高糖添加10%胎牛血清最為適用，另一只關(guān)于兔腎小管上皮細(xì)胞的情況，它所需要的是DMEM/F12混合培養(yǎng)基呀這其中還得補(bǔ)充胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白等因子才行，pH值要控制在7.2 - 7.4之間，培養(yǎng)箱得保持37℃體溫、5% CO?濕度飽和的狀態(tài)，首次換液在接種后24小時(shí)進(jìn)行，加入時(shí)要輕柔沿著壁面添加，以此避免沖起貼壁細(xì)胞。
兔原代細(xì)胞培養(yǎng)，污染防控是其成敗的關(guān)鍵所在，每一批血清在使用之前，都要經(jīng)過(guò)0.22μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾，并且在培養(yǎng)液之中加入1%雙抗，若是觀察到培養(yǎng)液呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，或者pH突然變黃，又或者細(xì)胞出現(xiàn)空泡，這就提示很可能發(fā)生了支原體污染，建議每周運(yùn)用PCR法檢測(cè)一次，一旦發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣本，要立刻丟棄，還要對(duì)培養(yǎng)箱進(jìn)行徹底消毒，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合的時(shí)候，按照1:2進(jìn)行傳代，傳代的次數(shù)不適合超過(guò)5代，再不這樣的話，原代特性就會(huì)漸漸喪失。
兔原代細(xì)胞鑒定方法有哪些
形態(tài)學(xué)觀察乃是最為基礎(chǔ)的鑒定手段，在倒置顯微鏡之下，兔原代成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)出長(zhǎng)梭形，其胞體透亮，排列成放射狀或者旋渦狀，兔腎小管上皮細(xì)胞則呈現(xiàn)為多邊形，呈鋪路石樣排列，細(xì)胞核清晰能夠看見(jiàn)，照下各種不同時(shí)間點(diǎn)的形態(tài)變化，將其與文獻(xiàn)里的典型圖片相對(duì)比，能夠初步判定細(xì)胞類(lèi)型是不是符合預(yù)期，留心原代細(xì)胞經(jīng)常會(huì)混雜著各種各樣的細(xì)胞，需要進(jìn)一步去做特異性染色。
針對(duì)兔源細(xì)胞挑選相應(yīng)抗體，像是用角蛋白抗體去標(biāo)記上皮細(xì)胞，波形蛋白抗體標(biāo)記成纖維細(xì)胞，這個(gè)免疫細(xì)胞化學(xué)染色能給出更可靠的證據(jù)，操作時(shí)先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，用過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源酶，一抗在4℃孵育過(guò)夜，二抗在室溫孵育30分鐘，DAB顯色后用蘇木精進(jìn)行復(fù)染。陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈棕黃色，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞來(lái)計(jì)算陽(yáng)性率，超過(guò)95%才可以認(rèn)定為目的細(xì)胞。并且流式細(xì)胞術(shù)也能夠用于批量檢測(cè)表面標(biāo)志物。
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