我認(rèn)識(shí)老張有七八年了，他是我的朋友，在一家從事生物技術(shù)的公司搞研發(fā)工作。上個(gè)月我倆碰了頭，老張一臉疲憊地向我傾訴苦衷：“最近為了提取原代細(xì)胞，我?guī)缀踹B著就得在實(shí)驗(yàn)室睡覺了?！?。
我向他詢問究竟是什么情況。他講公司承接了一個(gè)新的項(xiàng)目，這個(gè)項(xiàng)目需要大量運(yùn)用原代細(xì)胞來進(jìn)行藥物篩選，然而他們的團(tuán)隊(duì)歷經(jīng)兩個(gè)月的折騰，所分離出來的細(xì)胞，要么是活力處于很低的狀態(tài)，要么就是出現(xiàn)染菌而導(dǎo)致報(bào)廢。
老張面帶苦笑講道，培養(yǎng)基已經(jīng)更換了五六種之多，消化酶濃度也進(jìn)行了好幾次調(diào)整，然而最終的結(jié)果卻始終處于不穩(wěn)定狀態(tài)。于周會(huì)上老板居然三次點(diǎn)名提及他，致使他所承受的壓力極大，甚至到了失眠的地步。
聽他這般講，我反倒生出了興趣，畢竟我自身于這一行也已混跡了十年，明白原代細(xì)胞此物是何等的嬌貴，我對(duì)老張講，你莫要心急，把你全部的操作流程自始至終給我詳細(xì)梳理一遍。
原代細(xì)胞污染怎么辦
老張講，最為關(guān)鍵的問題便是污染，上月接連有三批組織樣本，經(jīng)過處理消化之后接種至培養(yǎng)瓶，次日于鏡下進(jìn)行觀察，培養(yǎng)基因而出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，并且還飄浮著絮狀物質(zhì)，通過革蘭氏染色予以查看，發(fā)現(xiàn)既有桿菌又存在球菌。
我詢問他獲取樣本的方式手段 ，他表明在上海浦東的動(dòng)物中心 ，于2025年12月15號(hào)當(dāng)日，是他親自前去取的小鼠的肝臟，在運(yùn)輸樣本時(shí)運(yùn)用了冰盒 ，半小時(shí)之內(nèi)就趕回至實(shí)驗(yàn)室。
我向他追問超凈臺(tái)是如何進(jìn)行準(zhǔn)備工作的，老張瞬間愣住沒多久，便說道，先是用紫外照射了三十分鐘，隨后進(jìn)行了十分鐘的通風(fēng)，接著用酒精擦拭了臺(tái)面，而且在操作的時(shí)候還點(diǎn)上了酒精燈，這么一聽感覺挺符合規(guī)范，然而問題恰恰就出在了細(xì)微的地方呀。
叫他去回想一下，將組織剪碎時(shí)用到的剪刀跟鑷子有沒有被共用。經(jīng)過好一陣子思索后，他面色發(fā)生了變化，說道：“確實(shí)如此呀，自始至終我就只用了一把剪刀以及一把鑷子，期間僅僅用酒精棉擦拭了一回?！薄?/p>
這下就契合無誤了。原代細(xì)胞開展培養(yǎng)而言最怕遭遇交叉污染之勢(shì)態(tài)狀況，一把剪刀針對(duì)多只動(dòng)物予以處理操作，或者在剪不同組織時(shí)未能清晰徹底地進(jìn)行清洗，細(xì)菌便會(huì)借助器械進(jìn)入下一份樣本之中。
我告知老張，做法正確的是，每剪完一只動(dòng)物的組織后，剪刀以及鑷子便要更換成一套全新的。要是條件存在限制，最少也得使用無菌水反復(fù)沖洗三次，接著浸泡在75%酒精里五分鐘，最終用滅菌紗布擦干。
老張猛地拍了一下大腿，隨后說道：“怪不得在那之后我使用抗生素卻毫無效果，原來是源頭根本就沒有得到有效的控制啊?！?。
原代細(xì)胞分離技巧
老張除跟我講了污染方面的問題外，還提及了另外一件讓他煩心的事事情。在2026年1月初的時(shí)候，他們進(jìn)行了一批大鼠心肌細(xì)胞的分離操作，使用胰酶消化了二十分鐘，之后終止消化并進(jìn)行離心，最終得到的細(xì)胞數(shù)量少得令人可憐，少到了那種程度。
他們?cè)?jīng)嘗試把消化的時(shí)間予以延長(zhǎng)，一直延長(zhǎng)到四十分鐘，如此一來，細(xì)胞數(shù)量確實(shí)增多了，然而，通過臺(tái)盼藍(lán)染色觀察之后發(fā)現(xiàn)，死亡率竟然超過了百分之六十。要是時(shí)間縮短些，縮短至十分鐘，卻整個(gè)根本無法消化下來。
我向他詢求，所運(yùn)用的胰酶濃度究竟是多少，他給出的回應(yīng)是零點(diǎn)二五，我輕搖著頭，向其表明不同的組織對(duì)于胰酶的耐受程度全然是不一樣的，像肝臟、腎臟這類屬于實(shí)質(zhì)器官的，以零點(diǎn)二五的濃度去進(jìn)行消化十五到二十分鐘是不存在問題的，然而心肌組織其結(jié)構(gòu)致密，纖維成分較多，是需要采用更低的濃度并配合多次消化才行的。
我向他推舉了一種方案，先是采用零點(diǎn)零五的胰酶于四度境下進(jìn)行冷消化六至八小時(shí)，促使那酶緩緩滲透進(jìn)去，隨后再放置到三十七度的環(huán)境中進(jìn)行溫消化十五分鐘，如此這般既能夠確保細(xì)胞產(chǎn)量，又能夠降低損傷。
老張聽聞后處于半信半疑之態(tài)，回去進(jìn)行了為期一周的嘗試，前天給我發(fā)送消息稱效果好得出奇。他選用了大鼠心臟，依照這個(gè)兩步消化法來操作，最終活細(xì)胞數(shù)量相較于之前增多了三倍，存活率達(dá)到了百分之九十以上。
他將此方法運(yùn)用于骨骼肌原代細(xì)胞分離方面，同樣是有效果的。當(dāng)下，其所在實(shí)驗(yàn)室的同事均著手學(xué)習(xí)這一辦法。
原代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)
之后老張請(qǐng)我吃飯，特意對(duì)我表示感謝，吃飯的時(shí)候他又提及另外一個(gè)坑，那就是培養(yǎng)基的pH，以及培養(yǎng)基的滲透壓。
他們所使用的DMEM培養(yǎng)基，始終放置于四度的冰箱之中，在使用之前將其取出，放置于三十七度的水浴里面進(jìn)行預(yù)熱，按照常理來說是沒有問題的，然而有一回他留意到細(xì)胞生長(zhǎng)得格外緩慢，貼壁率同樣很低。
他對(duì)培養(yǎng)基的 pH 進(jìn)行了測(cè)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)出偏堿的狀態(tài)，數(shù)值達(dá)到了八點(diǎn)零。究其緣故，是他所使用的培養(yǎng)瓶，在二氧化碳培養(yǎng)箱里的放置位置存在偏差，靠近箱門，進(jìn)而導(dǎo)致二氧化碳濃度處于不穩(wěn)定的狀況。
我跟他講，原代細(xì)胞對(duì)于pH的改變極為敏感，特別是像神經(jīng)元、心肌細(xì)胞這種終末分化的細(xì)胞。培養(yǎng)箱當(dāng)中的二氧化碳濃度需要定期運(yùn)用獨(dú)立探頭予以校準(zhǔn)，且培養(yǎng)瓶不可以堆疊得過于滿，瓶蓋同樣不可以擰得過于緊。
原本擺放位置的培養(yǎng)瓶被老張回去調(diào)整了，一批新的二氧化碳傳感器被他換了，緊接著細(xì)胞狀態(tài)馬上就得到改善了。2026年2月中旬的時(shí)候他做了那批原代肝細(xì)胞，像白蛋白分泌量這般的功能性指標(biāo)，相比之前提高了近乎一倍。
又存在著一個(gè)常見的坑，此坑便是關(guān)于細(xì)胞外基質(zhì)的包被情況啦。許許多多的實(shí)驗(yàn)室，在培養(yǎng)原代細(xì)胞之時(shí)，直接采用裸塑料培養(yǎng)皿，最終導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)不貼壁之狀況或者聚團(tuán)形成球狀呢。
之前老張養(yǎng)原代血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，碰到過這個(gè)問題；，我讓他去試試用明膠 ，或者膠原蛋白進(jìn)行包被；，他購(gòu)買了鼠尾膠原，按照每平方厘米兩微克此濃度包被兩小時(shí)，之后無菌風(fēng)干過夜 ；，第二天再去接種內(nèi)皮細(xì)胞，貼壁率從原本的百分之三十直接飆升至百分之八十五。
原代細(xì)胞保存方法
解決了分離以及培養(yǎng)的問題之后，老張又碰到了新的麻煩，那就是：原代細(xì)胞沒辦法進(jìn)行無限傳代，每一次都必須得重新去分離，這實(shí)在是太耗費(fèi)時(shí)間了。
由于公司項(xiàng)目存在大量需不斷重復(fù)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，以至于批間差異難以成功控制住。在2026年3月初的時(shí)候，他展開嘗試，對(duì)分離好的原代細(xì)胞予以凍存處理。而后進(jìn)行復(fù)蘇操作并檢測(cè)，結(jié)果顯現(xiàn)活率僅僅只有百分之四十出頭。
采用的凍存液是經(jīng)典配方，其中包含百分之九十的胎牛血清以及百分之十二的甲基亞砜。降溫程序運(yùn)用了程序降溫盒，先放置到零下八十度過夜，而后再轉(zhuǎn)移至液氮中。按常理推斷問題應(yīng)該不大。
關(guān)于凍存前細(xì)胞狀態(tài)如何，我向他進(jìn)行了問詢。他透露，對(duì)于貼壁細(xì)胞，先是運(yùn)用胰酶將其消化下來，隨即在室溫環(huán)境當(dāng)中添加了凍存液，爾后便裝入管中放置于降溫盒里了。
問題恰恰就出在這個(gè)地方。原初代的細(xì)胞是極為脆弱的，經(jīng)過消化之后的細(xì)胞得先行在充滿完全成分的培養(yǎng)基當(dāng)中恢復(fù)最少三十分鐘，使得細(xì)胞膜上面的蛋白重新整合起來，讓細(xì)胞骨架穩(wěn)定下來方才可以，之后再去開展凍存的操作。
再者，凍存的密度具有相當(dāng)關(guān)鍵性，有鑒于此，我向他提議，每毫升之中，活細(xì)胞數(shù)量起碼要達(dá)到兩百萬至五百萬個(gè)，要是活細(xì)胞數(shù)量太少，在復(fù)蘇之后便會(huì)極難生長(zhǎng)起來。此外，倘若將凍存液里的血清更換為專用的無血清凍存液，那么所呈現(xiàn)的效果相較之下將會(huì)更佳。
老張依照那樣做了，在2026年3月18號(hào)的時(shí)候，進(jìn)行了一批原代大鼠皮層神經(jīng)元的凍存，一周以后將其復(fù)蘇，活率達(dá)到了百分之七十八，雖說比不上直接運(yùn)用的新鮮細(xì)胞，但是對(duì)于大多數(shù)功能性實(shí)驗(yàn)而言已然足夠了。
如今，將原代細(xì)胞凍存視為常規(guī)操作的是他，每個(gè)批次當(dāng)中，至少會(huì)凍存五十管原代細(xì)胞，如此一來，大幅減少了動(dòng)物使用數(shù)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性也隨之提升了。
原代細(xì)胞鑒定方法
故事講述到這個(gè)地步，沒準(zhǔn)有的同志會(huì)發(fā)問：你究竟憑借啥知曉分離出來的細(xì)胞恰是你所需要的那般，而非摻和了別的細(xì)胞種類？
當(dāng)初老張也在這個(gè)坑中栽了跟頭，2025年11月，他們分離出一批原代肺成纖維細(xì)胞，依照形態(tài)觀察，認(rèn)為是 pure 的，然而將其送去第三方做STR鑒定時(shí)，卻發(fā)覺里面混雜著百分之三十的上皮細(xì)胞以及百分之十五的巨噬細(xì)胞。
這套數(shù)據(jù)一經(jīng)呈現(xiàn)，項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)瞬間陷入混亂狀態(tài)。在此之前，所有依托這批細(xì)胞所開展的實(shí)驗(yàn)成果，均已宣告無效，歷經(jīng)三個(gè)月的工作，就這樣付諸東流了。
我告知老張，形態(tài)學(xué)鑒定僅能夠當(dāng)作初步的判斷，必然要聯(lián)合免疫細(xì)胞化學(xué)亦或是流式細(xì)胞術(shù)去做純度方面的分析。舉例來講，要是分離肺成纖維細(xì)胞，那就采用波形蛋白當(dāng)作陽性標(biāo)志物，與此同時(shí)運(yùn)用角蛋白去排除上皮細(xì)胞的污染。
老張汲取了經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，當(dāng)下每次在分離完原代細(xì)胞之后，都會(huì)先行取一小部分來做免疫熒光鑒定，在確認(rèn)其純度已然達(dá)到百分之九十五以上之際，才會(huì)將其應(yīng)用于后續(xù)的大規(guī)模實(shí)驗(yàn)，標(biāo)點(diǎn)符號(hào)。
他還引入了熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)，針對(duì)一些如從脾臟中分離樹突狀細(xì)胞這類不易純化的細(xì)胞類型，若直接采用磁珠分選或者流式分選的方式，便能一步到位獲取到高純度細(xì)胞。
2026年4月10日那天，老張給我打來了電話，其聲音之中帶著興奮之情。他講公司那個(gè)卡頓了兩個(gè)多月時(shí)間的項(xiàng)目最終通過了內(nèi)部驗(yàn)收，老板于全員大會(huì)之上表揚(yáng)了他們那支團(tuán)隊(duì)。
他講，最大的感悟便是原代細(xì)胞培養(yǎng)這個(gè)事，細(xì)節(jié)對(duì)成敗起著決定性作用。從大的方面來說乃是組織樣本的采集與運(yùn)輸，從小的方面講就是培養(yǎng)瓶擰蓋時(shí)松緊程度，只要任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，那整批細(xì)胞就宣告報(bào)廢了。
此刻，他把成套的操作流程撰寫成了標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序 ，器械滅菌，乃其中首項(xiàng) ，組織剪碎，緊隨其后 ，酶用于消化 ，密度梯度離心 ，包被的是基質(zhì) ，接種有其密度 ，換液頻度需考量 ，凍存復(fù)蘇亦關(guān)鍵 ，每一頁之上 ，皆布滿注意事項(xiàng) ，密密麻麻。
照著這個(gè)流程操作的那群同事，其中那個(gè)新人研究生，最快用一周時(shí)間就能獨(dú)自分離出達(dá)標(biāo)的原代細(xì)胞。老張講，他終于能夠不必每日守在超凈臺(tái)跟前了。
倘若你同樣正在進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，那么不妨依照文中所提及的問題去對(duì)照一番，瞧瞧自身的操作流程當(dāng)中是否存在類似的盲點(diǎn)之處。污染的情況，產(chǎn)量較低的狀況，活力欠佳的現(xiàn)象，不貼壁的情形，批間差異較大的狀況，基本上都無法逃脫那幾個(gè)緣由?；ㄙM(fèi)一些時(shí)間將每一個(gè)步驟仔細(xì)摳細(xì)致密地弄清楚，最終的結(jié)果將會(huì)全然不一樣。
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