在上個月，我和一位從事食品檢測工作的老朋友老趙一起吃飯，他向我傾訴了諸多苦衷。
老趙在本地一家第三方檢測機構(gòu)干了八年，主要做殘留物分析。
他們實驗室在去年的時候，承接了一批新的項目，這些項目需要頻繁地運用ELISA試劑盒來開展篩查。
最初以為，這般成熟模樣的產(chǎn)物，不會冒怎樣的差錯，然而，接連三個月，都被攪擾得極為狼狽，是這樣的狀況，沒錯的。
他講道，你可曉得呀，存在著一批樣本，我們將其重復(fù)去做了四回，然而數(shù)據(jù)卻并非是正確的。
那段時間老趙天天加班到凌晨，整個人瘦了一圈。
后來他花了兩周時間重新復(fù)盤整個流程，才把問題徹底理清楚。
我覺得這段經(jīng)歷對很多同行都有參考價值，就請他詳細(xì)講了一遍。
將今天老趙曾經(jīng)踩過的坑，以及老趙總結(jié)出來的經(jīng)驗，書寫出來，期望能夠?qū)τ谡陂_展類似實驗的朋友起到幫助作用。
ELISA試劑盒最常見的三個誤區(qū)
第一個誤區(qū)：只看價格不看板內(nèi)差異
開始采購之初的老趙，因領(lǐng)導(dǎo)要求控制成本，故而挑選了報價為最低的一家供應(yīng)商。
試劑盒到貨后做標(biāo)準(zhǔn)曲線，R值看起來也不錯，他以為沒問題了。
結(jié)果，當(dāng)正式進行跑樣本這個操作時，對于同一個樣本而言，在不同的孔當(dāng)中所測出來的吸光度值，二者之間相差了將近百分之十五。
老趙回憶講，那時刻，我覺著是洗板機出現(xiàn)了狀況，校準(zhǔn)了一回又一回情況依舊這般。
嗣后，他向同行打聽，方知曉，部分低價的ELISA試劑盒，于板體注塑工藝方面，存在偷工減料之情形。
孔與孔之間的表面處理不均勻，導(dǎo)致抗體包被量不一致。
這種差異在標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液里表現(xiàn)不明顯，因為基質(zhì)干凈。
但一旦加上復(fù)雜的樣本基質(zhì)，差異就被放大了。
老趙最后換了另一家口碑更好的品牌，雖然單價貴了三分之一。
只不過，板內(nèi)變異系數(shù)，從先前的百分之十二，降低到了百分之三以內(nèi)，此后，孔間不一致的問題，再也未曾出現(xiàn)過。
他進行了一次算賬，原本是，采用低價盒子不斷重新去做，所消耗的人力成本，以及試劑耗材，這兩者加起來遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了節(jié)省下來的采購費用。
第二個誤區(qū)：忽視樣本基質(zhì)對捕捉抗體的干擾
老趙的項目主要檢測肉類組織中的殘留物。
按照說明書之上所講的方法去做樣本前處理，加標(biāo)回收率始終是偏低的狀態(tài)，僅僅只有大概60%。
他試過延長孵育時間、增加洗滌次數(shù)，都沒有明顯改善。
后來一位資深的老師傅提醒他：你要做一下基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
老趙這才有所察覺，說明書里所提及的樣本類型乃是血清，然而他所進行操作的卻是組織勻漿上清液。
兩者的蛋白濃度、脂肪含量、離子強度完全不同。
基質(zhì)里的某些成分，有可能會跟捕捉抗體產(chǎn)生非特異性結(jié)合，進而占據(jù)抗體位點。
或者改變抗原抗體的反應(yīng)動力學(xué)，導(dǎo)致檢測信號被抑制。
他用空白組織提取液來稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，重新制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
回收率一下子從60%提升到了92%。
老趙講，“此一教訓(xùn)，吾已銘記，于每一款ELISA試劑盒投入使用之前，皆須對樣本基質(zhì)的干擾情況予以驗證?！薄?/p>
第三個誤區(qū)：洗滌步驟流于形式，沒有控制洗滌液殘留
某次，老趙制備競爭法 ELISA 試劑盒時，發(fā)覺高濃度標(biāo)準(zhǔn)品的信號值相較于上次實驗，降低了許多。
他反復(fù)檢查試劑是否失效、孵育溫度是否準(zhǔn)確，都沒有問題。
在最后，將實驗記錄找出來，一條一條地去進行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，唯一出現(xiàn)的變化，乃是更換了一瓶用于洗滌的液體。
起初，新開啟的用于洗滌的液體瓶子標(biāo)簽之上寫明著“20倍濃縮”，隨后，他依據(jù)自身習(xí)慣將其稀釋了25倍。
洗滌緩沖液的離子強度不對，導(dǎo)致非特異吸附?jīng)]有被完全洗掉。
背景值升高，把真實信號壓下去了。
更為隱蔽的問題所在，乃是他所使用的洗板機，其吸液管路存在著一點堵塞的狀況的，每一個孔在洗完之后，都?xì)埩袅舜蟾?0微升的液體。
別小看這50微升殘留。
要是針對高濃度樣本的孔，殘留的液體就會將高濃度的分析物帶至下一個洗滌循環(huán)。
造成交叉污染。
如果是空白孔，殘留的洗滌液會稀釋下一步加入的酶標(biāo)抗體。
老趙運用移液槍進行了實測，結(jié)果表明，正常情況下的殘留應(yīng)當(dāng)是低于20微升的，然而，他所使用的機器卻出現(xiàn)了偏差，偏差范圍達到了50至80微升。
清洗管路、更換洗板頭之后，問題立刻解決了。
每當(dāng)他當(dāng)前使用ELISA試劑盒之前，都會運用紙巾吸干辦法以快速核查洗板機的殘留體積。
還會定期用酚紅溶液做洗板均勻性測試。
選對ELISA試劑盒的三個實操要點
要點一：根據(jù)檢測通量選擇板條式還是整板式
老趙的實驗室有時一天只測十幾個樣本，有時一天測兩百多個。
他發(fā)現(xiàn)板條式ELISA試劑盒更適合他們的工作節(jié)奏。
用多少拆多少條，剩下的放回鋁箔袋密封保存。
一整板式的，一旦拆封，就必定得一次用光，不然的話，凡是殘余的孔，吸附了水分，就會失去效用。
如果是固定的大批量檢測，整板式的批內(nèi)一致性更好。
因為整塊板的包被工藝比后組裝的板條更穩(wěn)定。
老趙的做法是：常規(guī)篩查用板條式，確實驗證用整板式。
要點二：查清楚試劑盒的檢測范圍是否覆蓋你的預(yù)期濃度
那次，老趙所購買的ELISA試劑盒，其檢測范圍為，從10皮克每毫升起，一直到1000皮克每毫升止。
他的樣本實際濃度普遍在2000以上。
超出檢測上限的結(jié)果沒有意義，只能稀釋后再測。
而稀釋會放大誤差，稀釋倍數(shù)越大，誤差越大。
后來，他養(yǎng)成了一個習(xí)慣，那就是在進行采購之前，要先去查詢 文獻，或者向同行詢問，以此 來弄清楚 同類樣本的濃度范圍。
然后選擇檢測范圍剛好覆蓋這個區(qū)間的試劑盒。
要是范圍窄得很，那高值樣本就得進行大倍數(shù)的稀釋；倘若范圍寬得不得了，低濃度區(qū)域的靈敏度就會顯得不足。
要點三：關(guān)注試劑盒的交叉反應(yīng)率
老趙有一次檢測A物質(zhì)，結(jié)果陽性樣本明顯偏多。
他用液相色譜-質(zhì)譜做確證，發(fā)現(xiàn)很多陽性其實是B物質(zhì)引起的。
原來的那一款ELISA試劑盒，其說明書上面寫著，和B物質(zhì)的交叉反應(yīng)率是8%。
也就是說，樣本里如果B物質(zhì)濃度較高，會被誤判為A物質(zhì)陽性。
對于篩查而言，這個交叉反應(yīng)率或許是能夠被接受的，然而老趙所負(fù)責(zé)的項目，其要求是假陽性率要低于五個百分點。
8%的交叉反應(yīng)率顯然不達標(biāo)。
更換成另外一款交叉反應(yīng)率比1%低的ELISA試劑盒以后，假陽性方面的問題得以解決。
老趙現(xiàn)在怎么驗證一批新的ELISA試劑盒
他說，每一批新到貨的試劑盒，上機正式使用之前必須做三件事。
第一條事項是，運用試劑盒自身所攜帶的標(biāo)準(zhǔn)品，去制作出一條毫無間斷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，于此同時，還要制備三個不同濃度的質(zhì)控品。
質(zhì)控品最好用獨立來源的，不依賴試劑盒自帶的。
觀察校準(zhǔn)曲線，看其是否展現(xiàn)出典型的S型，查看四個參數(shù)擬合之后的R方值，有沒有大于0.99。
第二件事：取三個不同濃度的真實樣本，每個濃度做五個重復(fù)。
計算板內(nèi)變異和板間變異。
板內(nèi)變異系數(shù)，其數(shù)值不超過百分之十，板間變異系數(shù)，其數(shù)值在此情形下不超過百分之十五了，這樣的狀況才能夠被認(rèn)定是合格的。
第三件事：做加標(biāo)回收實驗。
在樣本里加入已知量的標(biāo)準(zhǔn)品，計算回收率。
回收率在80%到120%之間說明基質(zhì)干擾可控。
假設(shè)回收率超越了此范圍，那么便要對前行處理方式予以優(yōu)化，或者去更換另外一種試劑盒。
到2025年3月的時候，一位被稱作老趙的人，借助這套驗證流程，為實驗室挑選出了七家供應(yīng)商所提供的產(chǎn)品。
最終選定了兩家作為固定供應(yīng)商。
之前的半年當(dāng)中，出于 ELISA 試劑盒質(zhì)量方面的問題而致使的數(shù)據(jù)異常，削減了八成。
他講，“好的試劑盒，并非是最貴的那種，也不是最便宜的那類，而是最適配你樣本類型的那個。”。
這句話我深以為然。
希望老趙的這段經(jīng)歷能給你一些參考。
若你亦在使用 ELISA 試劑盒，不妨去檢查一下上面所提及的那幾個細(xì)節(jié)。
也許會幫你少走一些彎路。
