做生命科學(xué)研究的朋友，大概都繞不開基因表達(dá)定量這件事。
你是否也曾碰到這般狀況，同一個樣本，多次重復(fù)去進(jìn)行實時熒光定量PCR，然而結(jié)果卻無法對應(yīng)，Ct值一會兒高一會兒低，使人全然摸不到頭緒。
我存在一位名為老張的朋友，于一間生物檢測公司從事研發(fā)工作，前段時間正是由于這件事情歷經(jīng)了長達(dá)大半個月的折騰。
他跟我談及那段經(jīng)歷之際，不停地直搖頭，聲稱那幾日就連做夢的時候，都一直在思索反應(yīng)體系究竟是哪兒出現(xiàn)了問題。
我覺著呀，他所擁有的經(jīng)驗，極其值得把它拿出來講一講，沒準(zhǔn)兒能夠幫到你，使得你少走好多的彎路呢。
老張現(xiàn)今是三十二歲的年紀(jì)，在蘇州工業(yè)園區(qū)那兒，于一家從事生物技術(shù)的公司，待了超過四年的時長。
他們所在的團(tuán)隊，主要從事的是環(huán)境樣本里微生物基因表達(dá)的分析工作，每天都要與實時熒光定量PCR進(jìn)行接觸。
今年四月上旬，公司收到了一批涉及土壤樣本的檢測差事，需要對其中特定的某種功能基因的表達(dá)程度進(jìn)行定量剖析。
搭建整個實驗體系的任務(wù)由老張負(fù)責(zé)，他依據(jù)之前用過的引物與程序，滿懷信心地開啟了上機(jī)操作的進(jìn)程，他上機(jī)了，他上機(jī)時信滿滿得很呦。
結(jié)果一經(jīng)出爐，他瞬間傻眼啦，這三個經(jīng)過重復(fù)操作的孔之間，其Ct值的差異竟然超過了1.5個循環(huán)呢。
依據(jù)行業(yè)當(dāng)中被大家所共同認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)，反復(fù)出現(xiàn)的孔的標(biāo)準(zhǔn)差要是超過了零點三，那么就極難確保數(shù)據(jù)是可靠的了。
實時熒光定量pcr重復(fù)性差怎么辦
老張第一反應(yīng)是加樣出了問題。
當(dāng)天他進(jìn)行操作，仔細(xì)回首思索，實情乃是時間緊迫，八連管排列妥當(dāng)之后，加樣之際，他的思緒竟兩次游離走神。
然而，他卻又覺著，不至于會有如此大的差別，這是為啥，只因使用的乃是那種帶有濾芯的槍頭，并且，他也都認(rèn)認(rèn)真真地進(jìn)行吹打操作了。
他依舊再次做了一回，此次每一步都把動作放緩一些，添加完一個樣本后就輕輕地扣上蓋子。
可是，到了第二天跑出來的那個結(jié)果呀，其重復(fù)性相較于上一次情況而言，還要更差一些呢，存在著有的孔直接就沒有出現(xiàn)擴(kuò)增曲線這種狀況。
這下老張徹徹底底地沒有辦法保持淡定了，他把他自己關(guān)進(jìn)了實驗室里，對著儀器發(fā)了兩個小時的呆。
排查模板和引物的質(zhì)量
他決定從頭開始排查。第一步先檢查引物和探針。
這一組引物，是在半年之前合成的，一直被放置于負(fù)二十度的冰箱內(nèi)，按照常理來推斷，應(yīng)當(dāng)是不會發(fā)生降解現(xiàn)象的。
然而，他依然再次進(jìn)行了稀釋操作，制作出了一管全新的工作液，與此同時，還順便開展了一次瓊脂糖凝膠電泳操作。
這個現(xiàn)象表明，電泳圖所呈現(xiàn)出來的情況是，引物二聚體的條帶相對比較亮，這意味著引物自身實際上是存在著一定程度的非特異性配對的。
老張急忙去查當(dāng)時的設(shè)計記錄，查到正向引物的3'端存在兩個連續(xù)的G，而這種結(jié)構(gòu)極易形成發(fā)夾。
他馬上就此做出決定，要再次去設(shè)計一對引物，將那3'端位置上的GC所含比例把控在40%直至60%這個范圍之內(nèi)。
實時熒光定量pcr的反應(yīng)體系配制技巧
新引物到貨需要三天時間，老張也沒閑著，他開始優(yōu)化反應(yīng)體系。
他平日里慣于把預(yù)混液，以及引物，還有探針，甚至水與模板，全都核算好體積，一次性配制成一個大反應(yīng) mix。
然而，他卻遺漏了不同樣本相互之間的模板濃度存在的差異情況。土壤樣本所提取出來的DNA之中常常會帶有諸如腐殖酸之類的抑制劑。
這些抑制劑，會在每個反應(yīng)孔里進(jìn)行不均勻的分布，進(jìn)而使得同一塊板上，不同孔的擴(kuò)增效率不一致。
老張采用了一個顯得愚蠢的方法，這個方法是，針對每一個樣本，單獨去配制預(yù)混合的液體，在完成分裝之后，再分別加入與之相對應(yīng)的模板。
他又將每個反應(yīng)體系的總體積，從二十微升增大到二十五微升，以此降低隨機(jī)誤差所產(chǎn)生的影響。
三天后新引物到了，老張先做了一輪標(biāo)準(zhǔn)曲線預(yù)實驗。
他用已知濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行十倍梯度稀釋，一共做六個點。
擴(kuò)增結(jié)束以后，相關(guān)系數(shù)于標(biāo)準(zhǔn)曲線上已經(jīng)達(dá)到了0.998，擴(kuò)增效率為98%，此數(shù)值很接近理論值為100%。
熔解曲線也只有一個尖銳的峰，說明引物特異性很好。
老張心里踏實了不少，但徹底解決問題還差一步。
實時熒光定量pcr的儀器校準(zhǔn)和耗材選擇
他留意到，實驗室里的那臺，實時熒光定量PCR儀，已然持續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)了，差不多一年的時間。
上次做光路校準(zhǔn)和溫度驗證，還是去年六月份的事。
他跟儀器管理員申請做了一次全面的性能驗證。
結(jié)果顯示，第六通道的熒光采集值比標(biāo)定值低了將近百分之十二。
溫度模塊于第九十六孔處的偏差，達(dá)到了正零點五度以及負(fù)零點五度，然而呢，平常所要求的情況是，不得超過零點三度這樣一個數(shù)值呀。
老張趕緊聯(lián)系廠家工程師做了校準(zhǔn)和溫控模塊的維修。
他與此同時更換了一批實驗耗材，此前所使用的八連管乃是國產(chǎn)范疇內(nèi)的一個雜牌產(chǎn)品，其管壁的厚度呈現(xiàn)出不太均勻的狀況。
他做了更換，換的是某個知名的、進(jìn)口的品牌的白色的管，聽說據(jù)說能憑借這個使得熒光信號的采集效率提升不少。
白色管壁可以反射更多的激發(fā)光，減少孔與孔之間的交叉干擾。
他還進(jìn)行了確認(rèn)，每一根管子的蓋子都需要蓋得嚴(yán)實緊密一點不過于緊密，不然會對光學(xué)檢測造成影響，進(jìn)而產(chǎn)生不良后果。
實時熒光定量pcr的數(shù)據(jù)分析注意事項
等待儀器校準(zhǔn)完畢，新的耗材到達(dá)，之后，老張再次去走了一回那一批土壤樣本所經(jīng)歷的流程。
此次，他另外設(shè)置了無模板的對照，還設(shè)置了無反轉(zhuǎn)錄的對照，以此來對污染以及基因組殘留進(jìn)行監(jiān)控。
擴(kuò)增曲線出來的時候，他守在電腦屏幕前一個一個孔地看。
三個彼此重復(fù)的孔范圍之內(nèi)的Ct值，其標(biāo)準(zhǔn)偏差全都被控制在零點二這個數(shù)值以內(nèi)，擴(kuò)增曲線所呈現(xiàn)的指數(shù)期斜率，基本上處于平行的狀態(tài)。
熔解曲線還是沒有雜峰，陰性對照直到四十個循環(huán)都沒有起峰。
老張長出了一口氣，這一輪的苦總算沒有白吃。
但真正讓他學(xué)到東西的，是后續(xù)的數(shù)據(jù)分析過程。
他以往做實時熒光定量PCR，慣于徑直采用儀器自身所帶的軟件自行計算Ct值以及基線。
這次他手動檢查了每一個反應(yīng)孔的基線設(shè)置。
有幾個孔的基線起點，被他發(fā)現(xiàn)設(shè)在了循環(huán)數(shù)三以及十五那里，并且擴(kuò)增曲線在第十循環(huán)的左右時段，就開始出現(xiàn)抬升的情況。
這致使自動計算得出的Ct值相較于實際情況偏大，老張再度手動對基線起點進(jìn)行設(shè)定，將其下調(diào)至循環(huán)數(shù)六到十八。
將那之后的幾個樣本的Ct值進(jìn)行調(diào)整，平均降低了零點六個循環(huán)，三個重復(fù)孔的數(shù)據(jù)，變得更加一致了。
實時熒光定量pcr的閾值線和參考基因選擇
他思索了內(nèi)參基因的挑選相關(guān)情況，團(tuán)隊始終將16S rRNA用作土壤樣本的內(nèi)參基因。
不同土壤樣本里，微生物群落的構(gòu)成存在很大差異，不同菌種之間，16S rRNA的拷貝數(shù)懸殊。
老張查閱了文獻(xiàn)，這文獻(xiàn)是最近兩年的，查閱后發(fā)現(xiàn)，有人建議針對特定環(huán)境的樣本，使用多個內(nèi)參基因，去取幾何平均值。
他再次從這一批樣本當(dāng)中，挑選出了三個候選的內(nèi)參基因，分別是，16S rRNA，還有RpoB，以及RecA。
先借助實時熒光定量PCR，分別去測定它們的Ct值，之后呢，再運(yùn)用專業(yè)軟件，來分析表達(dá)穩(wěn)定性。
進(jìn)而發(fā)覺，有著最佳穩(wěn)定性表現(xiàn)的是RpoB ，但在這個樣本組當(dāng)中 ，系數(shù)之變異呈現(xiàn)明顯偏高態(tài)勢的卻是16S rRNA。
換成RpoB當(dāng)作內(nèi)參之后的老張，最終數(shù)據(jù)里的組內(nèi)變異減小了差不多百分之四十。
那天下午老張請我喝咖啡，說起這件事時語氣特別感慨。
他講，進(jìn)行實時熒光定量PCR，看起來仿佛僅僅是配制一個反應(yīng)。然后，把它放置到機(jī)器上。最后，得出一個數(shù)據(jù)這般輕易。
但任何一個環(huán)節(jié)出點小問題，最后出來的數(shù)據(jù)都可能完全沒法用。
引物進(jìn)行設(shè)計，試劑開展分裝，儀器查看狀態(tài)，耗材考量品質(zhì)，基線實施設(shè)定，內(nèi)參予以選擇，每一個步驟都必須認(rèn)真對待，不能馬虎。
他專門特意對我進(jìn)行提醒，要是實驗重復(fù)性始終老是沒辦法搞定，那么能夠先從加樣的方式以及引物的質(zhì)量方面開始查找。
這兩個環(huán)節(jié)出問題的概率最高，解決之后大部分情況都能改善。
他在那之后，將那段時期所踩到的坑，整理成了一份內(nèi)部操作手冊，而后把它發(fā)送到了公司共享盤里。
在上個月的時候，他們那個團(tuán)隊又接納了一批底泥樣本，他依照優(yōu)化過后的流程，從起初開始完整地奔跑運(yùn)作了一回。
結(jié)果特別漂亮，三個生物學(xué)重復(fù)之間的標(biāo)準(zhǔn)差最大才零點二一。
連隔壁做代謝組學(xué)的同事都跑來問他用的什么秘訣。
老張講，哪里會存在什么所謂的特殊訣竅呀，僅僅是把每一個步驟，都看作是最為關(guān)鍵重要的一個步驟，然后如此去做而已。
要是你同樣在開展與之相仿的實時熒光定量PCR試驗，那不妨依據(jù)此來核查一下自身的操作處理。
瞅一瞅引物的熔解曲線是否為單峰，瞧一瞧重復(fù)孔之間的 Ct 值差異是否顯著。
重新查看一下，你所用的儀器于近期是否進(jìn)行過校準(zhǔn)操作，其使用的耗材是否適配該機(jī)器的光學(xué)系統(tǒng)呢。
這些問題，看上去瑣碎，然而常常是它們，暗暗地偷走了你的數(shù)據(jù)重復(fù)性。
期望你們在讀完老張所歷經(jīng)的事情之后，能夠減少幾次去撞那南墻的情況，并且能夠更早地獲取到穩(wěn)定且依靠得住的結(jié)果。
