為什么我的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)總是不穩(wěn)定
上個(gè)月在杭州濱江的一個(gè)生物技術(shù)公司，我見到老朋友王磊。
穿著白大褂的他，從實(shí)驗(yàn)室走了出來，他的眼睛里帶著血絲，顯然一看就是經(jīng)過了熬夜去做實(shí)驗(yàn)這一狀況。
王磊身處一家第三方的檢測(cè)機(jī)構(gòu)里頭，充當(dāng)著技術(shù)主管的職位，司職專門針對(duì)環(huán)境樣本所開展的酶活性檢測(cè)工作。
談及最近的狀況，他發(fā)出長(zhǎng)長(zhǎng)的嘆息講道，“近來遭受生化試劑盒極大的困擾，針對(duì)同一個(gè)樣本進(jìn)行了三次測(cè)量，然而得出的結(jié)果差異程度極為夸張?！薄?/p>
我向他詢問究竟是怎么一回事，他拽著我來到了旁邊的那家咖啡館，將這長(zhǎng)達(dá)三個(gè)月的經(jīng)歷一口氣毫無保留地傾訴了出來。
今年二月上旬，王磊所在的公司承接了一批土壤樣本，需要對(duì)其之內(nèi)的過氧化氫酶活性展開測(cè)定。
往日里，他們采用傳統(tǒng)滴定法，然而樣本數(shù)量眾多，耗費(fèi)時(shí)間漫長(zhǎng)，手部只要略微顫抖一下，誤差便會(huì)超出百分之十。
主管催著他提高效率，王磊就想到改用市面上的生化試劑盒。
他于某電商平臺(tái)進(jìn)行搜索，搜索的內(nèi)容為“過氧化氫酶試劑盒”，之后他看中了一個(gè)品牌，該品牌銷量處于靠前位置，并且其價(jià)格并不昂貴，一盒五十個(gè)樣的情況下共需八百塊。
三天后試劑盒到貨，他按說明書加樣、孵育、用酶標(biāo)儀讀數(shù)。
頭一回做出來的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)僅僅是零點(diǎn)九一，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及零點(diǎn)九九的合格標(biāo)準(zhǔn)線，差得遠(yuǎn)呢。
王磊覺得是自身操作欠缺熟練度，再次進(jìn)行了重復(fù)，然而系數(shù)卻降至零點(diǎn)八八。
用生化試劑盒踩過哪些坑
那兩天他反復(fù)看說明書，琢磨是不是樣本前處理出了問題。
他的實(shí)驗(yàn)室處于蕭山，三月天氣仍存有涼意，他每日清晨七點(diǎn)便抵達(dá)，直至晚上十點(diǎn)才離開。
第三次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，他將使用的緩沖液換成了新鮮配制而成的緩沖液，并且把樣本離心的轉(zhuǎn)速，從之前的三千轉(zhuǎn)提升到了一萬兩千轉(zhuǎn)。
結(jié)果依然不理想，空白對(duì)照的吸光度竟然比樣本還高。
試劑盒本身存在問題，這使得王磊開始產(chǎn)生懷疑，他因而聯(lián)系了廠家技術(shù)，然而，對(duì)方卻讓他去重新做標(biāo)準(zhǔn)品梯度。
“王磊回憶當(dāng)時(shí)的心情，既煩躁又不服氣，表示標(biāo)準(zhǔn)品濃度自己算錯(cuò)了在他看來是不可能的事，畢竟之前他算過兩遍?！?。
他從事了嘗試，運(yùn)用另外一家進(jìn)口品牌所出品的試劑盒開展對(duì)比工作，針對(duì)同一個(gè)樣本，該進(jìn)口盒子的標(biāo)準(zhǔn)曲線系數(shù)達(dá)到了零點(diǎn)九九五。
此時(shí)，他清楚了，并非是自身操作存在問題，而是那一款價(jià)格低廉的試劑檢測(cè)盒的組成成分不穩(wěn)定。
讓他愈發(fā)生氣的是，他把數(shù)據(jù)傳送給了廠家，可對(duì)方最終認(rèn)可是標(biāo)準(zhǔn)品于運(yùn)輸進(jìn)程里有可能失去活性了。
王磊經(jīng)此一事受到了教訓(xùn)，他講出這樣的話來：“在這之前呀，一直覺得生化試劑盒不過就是那種工具盒罷了，反正哪一家生產(chǎn)的都能夠同樣去使用呢。”。
現(xiàn)在，他歸納出了三個(gè)方面的教訓(xùn)，其一，并非僅僅著眼于銷量以及價(jià)格，而是必須去核查廠家是否提供了質(zhì)控報(bào)告。
在收到試劑盒之后，要先去做預(yù)實(shí)驗(yàn)，然后通過用已知活性的標(biāo)準(zhǔn)品，要來驗(yàn)證線性范圍，千萬不要直接就將真實(shí)樣本給應(yīng)用上去。
保存條件得嚴(yán)格把控，有一些組分非得在負(fù)二十度且避光的環(huán)境下才行，普通冰箱的冷凍室因?yàn)闇囟炔▌?dòng)幅度較大，所以會(huì)致使其失效。
怎么選生化試劑盒才對(duì)
4 月中旬的時(shí)候，王磊又將開展一批污水處理廠活性污泥樣本的檢測(cè)工作，此次所檢測(cè)的項(xiàng)目是脫氫酶活性。
他耗費(fèi)了整整三天時(shí)間來篩選試劑盒，首先羅列出五個(gè)主流廠家，接著前往各個(gè)廠家的官網(wǎng)去下載說明書。
著重留意幾個(gè)指標(biāo)：檢測(cè)的限定界限，定量的限定界限，線性所涵蓋范圍，批次內(nèi)部以及批次之間的變異系數(shù)。
他又撥通電話給兩個(gè)廠家的技術(shù)支撐人員，詢問他們那里的標(biāo)準(zhǔn)品行用的是什么來定值，是否存在第三方檢測(cè)報(bào)告。
最終，他挑選了一款國產(chǎn)試劑盒，其價(jià)格處于適中水平，相較于最便宜的那款，貴了百分之四十，而且它的參數(shù)清晰寫明批間變異系數(shù)小于百分之五。
試劑盒到貨。之后，他首先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。其相關(guān)系數(shù)為零點(diǎn)九八，仍處于可接受范圍之內(nèi)。
不過呢，他并沒有趕忙去測(cè)樣本，反而是又進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。他取了一份混合樣本，把這份混合樣本分成了三份，其中一份是不添加標(biāo)準(zhǔn)品的，另外兩份則分別添加了低濃度以及高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。
低濃度的回收率為百分之九十一，高濃度的回收率是百分之九十七，這兩者都處于在百分之八十五至百分之一百一十五的合格范圍之內(nèi)。
他這才懷揣著放心的狀態(tài)，將全部六十個(gè)樣本拿去上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果在一天之內(nèi)就全部得出了，其中重復(fù)樣本的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅僅為百分之三點(diǎn)二。
生化試劑盒操作要注意啥
王磊說，方法學(xué)驗(yàn)證只是第一步，操作細(xì)節(jié)才是決定成敗的關(guān)鍵。
他列舉了一個(gè)事例，那就是用于加樣的槍頭，存在這樣的情況，有的人出于節(jié)省費(fèi)用的目的而進(jìn)行重復(fù)使用，先經(jīng)過清洗之后再予以烘干處理，然而實(shí)際上其內(nèi)壁所殘留的樣本會(huì)對(duì)下一管造成污染。
在他的實(shí)驗(yàn)室之中，有著這樣一項(xiàng)規(guī)定，那就是所有與試劑盒相關(guān)的操作，都必須要使用帶有濾芯的無菌槍頭，而且這個(gè)操作要求是一槍一換。
存在著孵育溫度以及時(shí)間的把控，部分生化試劑盒規(guī)定為三十七度進(jìn)行水浴，然而水浴鍋的溫度均勻程度常常欠佳。
王磊采取的辦法是，將其更換為金屬浴模塊，在開機(jī)之后，提前半個(gè)小時(shí)使其開啟，進(jìn)而讓溫度能夠保持穩(wěn)定狀態(tài)，隨后，運(yùn)用經(jīng)過校準(zhǔn)的溫度計(jì)，對(duì)孔內(nèi)溫度進(jìn)行實(shí)地測(cè)量。
顯色反應(yīng)絕不能夠掉以輕心。他講上個(gè)月存在一位實(shí)習(xí)生，同時(shí)進(jìn)行了兩塊板的操作。添加顯色劑的時(shí)間段竟相差三分鐘，最終兩塊板呈現(xiàn)出的讀數(shù)相差了百分之十五。
此時(shí)，他們實(shí)驗(yàn)室有著這樣的規(guī)定，從增添顯色劑開始，到將其放置于酶標(biāo)儀那兒去進(jìn)行讀數(shù)，這二者之間的間隔，必須要嚴(yán)格把控在說明書所要求的一分鐘之內(nèi)，一旦超出這個(gè)時(shí)間，那就得重新去做。
王磊自行設(shè)計(jì)了一個(gè)操作核對(duì)表，將其張貼在實(shí)驗(yàn)臺(tái)旁邊，該核對(duì)表涵蓋了試劑解凍時(shí)間，包含離心轉(zhuǎn)速，還有孵育溫度等二十多個(gè)檢查項(xiàng)。
數(shù)據(jù)異常時(shí)怎么做排查
即便按標(biāo)準(zhǔn)流程做，偶爾也會(huì)遇到離譜的結(jié)果。
五月剛剛開始的某一個(gè)夜晚，王磊于檢測(cè)一批土壤脲酶活性進(jìn)程之際，發(fā)覺所有樣本的吸光度均與空白極為臨近。
他第一反應(yīng)不是懷疑樣本本身沒活性，而是先做系統(tǒng)排查。
他把先前經(jīng)過驗(yàn)證且合格的質(zhì)控樣本拿出來，再次進(jìn)行測(cè)量，最終結(jié)果呈現(xiàn)正常狀態(tài)，這表明試劑盒并未出現(xiàn)損壞情況。
接著，他對(duì)樣本保存記錄展開檢查，隨即發(fā)覺，這批土壤在取樣之后，被放置于四度的冰箱之內(nèi)，歷經(jīng)了整整兩周的時(shí)間，方才進(jìn)行處理。
通過查閱文獻(xiàn)方才知曉，脲酶于低溫潮濕的環(huán)境之中會(huì)漸漸地失去活性，兩周的時(shí)間很有可能已降解了超過百分之六十。
他立刻聯(lián)系采樣同事，確認(rèn)樣本是取回來就忘了。
王磊講道，碰到異常情況時(shí)，不要急著去怪罪試劑盒，而是需要依照相應(yīng)順序進(jìn)行排查，具體順序?yàn)?，試劑盒的質(zhì)量控制情況，樣本的前期處理狀況，樣本的保存條件怎樣，操作步驟是否正確。
他另外養(yǎng)成了一種習(xí)慣，每回的實(shí)驗(yàn)，都留出最少三個(gè)重復(fù)的質(zhì)控樣本，夾在等待檢測(cè)的樣本中間。
假使質(zhì)控樣本結(jié)果出現(xiàn)漂移，那么整批數(shù)據(jù)就得作廢。要是質(zhì)控處于正常狀態(tài)，然而僅有個(gè)別樣本呈現(xiàn)異常，那么問題便存在于樣本自身了。
生化試劑盒的未來趨勢(shì)
聊到最后，王磊說起今年四月參加上海一個(gè)分析儀器展的見聞。
有好幾家國內(nèi)的廠商，推出了全流程預(yù)分裝的雙抗夾心法試劑盒，他看到了，并且其中連標(biāo)準(zhǔn)品都預(yù)凍干在孔里。
用戶僅需添加樣本以及緩沖液，在孵育之后直接進(jìn)行讀板，手工這種操作所花費(fèi)的時(shí)間由兩小時(shí)被縮短至二十分鐘。
存在一些生產(chǎn)廠家，正在致力于開發(fā)手機(jī)應(yīng)用程序，借助普通的手機(jī)攝像頭，足以讀取試紙條或者微孔板呈現(xiàn)出的顏色，并不需要使用價(jià)格高昂的酶標(biāo)儀。
王磊認(rèn)為，這些新技術(shù)為基層實(shí)驗(yàn)室?guī)砀Ｒ簦c此同時(shí)，他還進(jìn)行提醒，自動(dòng)化并不意味著能夠省去方法學(xué)驗(yàn)證。
當(dāng)前，他所秉持的原則是，無論哪一款試劑盒，在拿取回來之后，都要先采用自身的樣本基質(zhì)去開展一次全面且完整的驗(yàn)證操作，隨后將所獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行存儲(chǔ)，以此當(dāng)作基準(zhǔn)。
并非所有價(jià)格貴的都是好的，那些價(jià)格便宜的基本上靠不住，處于中等價(jià)位的，只要花些心思去驗(yàn)證，完全能夠滿足日常檢測(cè)的需求。
這是王磊用三次失敗的實(shí)驗(yàn)和一個(gè)多月失眠換來的經(jīng)驗(yàn)。
要是你同樣是借助生化試劑盒去開展酶活性或者代謝物檢測(cè)工作，那么不妨先耗費(fèi)兩天時(shí)間來驗(yàn)證線性范圍以及加標(biāo)回收率。
保證能順順利利出數(shù)據(jù)的后續(xù)幾百個(gè)樣本，是建立在經(jīng)過驗(yàn)證通過的試劑盒，且遵循磨刀不誤砍柴工這一原則基礎(chǔ)之上的。
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