朋友老張的煩惱：PCR擴(kuò)增怎么就這么慢？
我結(jié)識(shí)了一位從事分子診斷試劑研發(fā)工作的友人, 老張, 于蘇州工業(yè)園區(qū)的一家生物科技公司任職達(dá)五年之久。他始終承擔(dān)著病原體檢測(cè)試劑的開(kāi)發(fā)任務(wù), 手里所負(fù)責(zé)的項(xiàng)目接連不斷, 按常理而言經(jīng)驗(yàn)十分豐富, 開(kāi)展工作理應(yīng)輕松嫻熟。然而在去年下半年期間, 他遭遇了一件令他極為頭疼且棘手的事情。
老張所在公司承接了新項(xiàng)目, 要為某三甲醫(yī)院研發(fā)一套呼吸道病原體多重檢測(cè)試劑盒, 項(xiàng)目規(guī)定三個(gè)月內(nèi)達(dá)成從設(shè)計(jì)至初步驗(yàn)證的整個(gè)流程, 老張當(dāng)時(shí)拍著胸脯應(yīng)承下來(lái)了, 心里想著不就是PCR嘛, 自己做過(guò)上千回, 熟悉得很。
結(jié)果才剛開(kāi)始上手就出現(xiàn)卡住的情況了。他所使用的是傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增試劑盒, 每一次完成一輪擴(kuò)增, 時(shí)間短則一個(gè)半小時(shí), 長(zhǎng)則兩個(gè)小時(shí)。一個(gè)完整的實(shí)驗(yàn)流程, 涵蓋從樣本處理、核酸提取到對(duì)擴(kuò)增、電泳檢測(cè), 一天下來(lái)能夠做完三個(gè)樣本就已經(jīng)算是不錯(cuò)的了。然而項(xiàng)目需要一同測(cè)試二十多種病原體的引物組合, 每一對(duì)引物都要反復(fù)地對(duì)退火溫度、循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化, 老張計(jì)算了一下, 按照這樣的速度, 僅僅引物篩選就需要花費(fèi)兩個(gè)多月的時(shí)間。
PCR擴(kuò)增試劑盒的選擇，到底看什么指標(biāo)？
有天晚上, 老張跟我一起喝酒, 期間他開(kāi)始吐槽, 言道如今市面上的PCR擴(kuò)增試劑盒品種繁多, 各式各樣, 其中有的吹噓自身靈敏度頗高, 有的宣稱特異性良好, 另外還有的號(hào)稱能夠在常溫狀態(tài)下進(jìn)行運(yùn)輸。然而, 他最為核心的痛點(diǎn)在于, 速度實(shí)在是太過(guò)緩慢了。就此情況, 他詢問(wèn)我究竟該如何進(jìn)行選擇。
我盡管不開(kāi)展PCR實(shí)驗(yàn), 然而聽(tīng)過(guò)好些從事研發(fā)的朋友談?wù)撨@個(gè)事情。我對(duì)他講, 挑選快速PCR擴(kuò)增試劑盒, 你必須先弄明白自身所需的是什么。首要的指標(biāo)便是擴(kuò)增時(shí)間。傳統(tǒng)的試劑盒達(dá)成30至35個(gè)循環(huán)起碼得耗費(fèi)60至90分鐘, 可性能優(yōu)良的快速試劑盒能夠?qū)⒋藭r(shí)間壓縮至20至30分鐘乃至更短。第二項(xiàng)指標(biāo)是酶的耐熱性以及保真度, 要是速度太快而酶無(wú)法跟上, 擴(kuò)增效率便會(huì)降低, 產(chǎn)物質(zhì)量同樣會(huì)受到影響。排在第三位的是兼容性, 你所使用的設(shè)備是否能夠?qū)焖俪绦蛴枰灾С? 存在一些老款的PCR儀, 其升溫的速度并不理想, 即便更換了快速試劑盒, 也無(wú)法正常運(yùn)行。
老張聽(tīng)聞后, 不停地直搖頭, 聲稱那些指標(biāo)他自然是曉得的, 然而關(guān)鍵在于, 在市面上, 真正能夠達(dá)成又快且又穩(wěn)這種狀態(tài)的試劑盒, 他至今尚未尋覓到合適的。
反復(fù)嘗試失敗，老張差點(diǎn)放棄項(xiàng)目
那段時(shí)間, 老張嘗試了好些品牌的快速PCR擴(kuò)增試劑盒, 其中, 有一個(gè)宣稱20分鐘就能出結(jié)果的, 他拿著實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板去進(jìn)行測(cè)試該項(xiàng)目。結(jié)果, 擴(kuò)增曲線倒是很快就出現(xiàn)了, 然而, CT值卻明顯顯著居高，相較于正常標(biāo)準(zhǔn)程序, 多增長(zhǎng)了三四個(gè)循環(huán), 這表明該試劑盒的擴(kuò)增效率有所差勁欠妥。另外, 還有一個(gè)品牌, 在測(cè)試時(shí), 雖然速度挺快, 但是批間差異居然相當(dāng)大, 昨天使用同一批引物時(shí)運(yùn)行情況良好順利, 可今天只需更換了新的一管試劑, 曲線就出現(xiàn)了異常歪曲。
令他最為崩潰的曾經(jīng)有一回, 他擴(kuò)增那個(gè)數(shù)量少的靶標(biāo)運(yùn)用快速試劑盒, 結(jié)果出現(xiàn)了二條不是想要的帶子, 在電泳時(shí)圖像模糊不清。項(xiàng)目負(fù)責(zé)人催促急切, 老張接連加了三天班, 眼睛熬得特別紅, 可依舊沒(méi)弄好。他跟我打電話講, 真的想賭氣, 不干這檔子事了, 就算這個(gè)項(xiàng)目做成功了, 試劑盒的靈敏程度也不符合臨床所需條件。
我那時(shí)勸他別著急, 我講PCR擴(kuò)增試劑盒此物, 從本質(zhì)上來(lái)說(shuō)是酶與緩沖體系的組合, 每一家的配方差別極大。有的是為了追求速度而犧牲了特異性, 有的是為了保真度而把速度降低了。你所需要的是一款在速度、特異性以及穩(wěn)定性這三個(gè)維度上均能平衡妥當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品。
轉(zhuǎn)機(jī)出現(xiàn)在一次行業(yè)交流會(huì)
在去年十一月之末, 老張前往上海, 參與一場(chǎng)分子診斷技術(shù)論壇。于會(huì)上, 有一個(gè)名為“迅準(zhǔn)生物”的展位。此展位陳列展示出了他們的主打產(chǎn)品, 那是一款快速PCR擴(kuò)增試劑盒。老張起初并未懷揣太大期望, 然而展位上的技術(shù)負(fù)責(zé)人遞予他一份實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù), 他看后即刻愣住了。
有所顯示的是, 運(yùn)用這款試劑盒去跑35個(gè)循環(huán), 其總耗時(shí)僅僅為22分鐘, 并且擴(kuò)增效率達(dá)到了95%以上。更為關(guān)鍵之處在于, 他們把試劑盒跟市面上五種主流品牌的對(duì)比數(shù)據(jù)都列舉了出來(lái), 在處于低拷貝數(shù)模板（10 copies/反應(yīng)）的情形下, 非特異性擴(kuò)增率低于0.5%。老張當(dāng)場(chǎng)就要了兩盒樣品, 帶著回去連夜進(jìn)行測(cè)試。
他選用手頭那些極難處理的引物, 搭配這款超速PCR擴(kuò)增試劑盒, 進(jìn)行上機(jī)操作, 做了三個(gè)重復(fù)。結(jié)果, 22分鐘之后得出結(jié)果, 三個(gè)復(fù)孔的CT值之間相差不足0.3, 擴(kuò)增的曲線呈現(xiàn)平滑態(tài)勢(shì), 不存在雜峰。彼時(shí), 老張于實(shí)驗(yàn)記錄本之上撰寫了一行文字: “此乃半年時(shí)間內(nèi)里, 首個(gè)通過(guò)快速模式跑出來(lái)的潔凈電泳圖?！?。
快速PCR擴(kuò)增試劑盒，到底改變了什么？
后面老張跟我講, 曾經(jīng)他一直覺(jué)得快速與穩(wěn)定沒(méi)辦法同時(shí)得到, 然而使用了這款試劑盒后, 他對(duì)快速PCR擴(kuò)增試劑盒的認(rèn)識(shí)完全變了。他講, 真正的快速并非單純縮短程序時(shí)間, 而是在酶分子層面進(jìn)行重新設(shè)計(jì)。這款試劑盒用到的是經(jīng)過(guò)定向進(jìn)化的高保真DNA聚合酶, 在72℃延伸階段其速度比普通Taq酶快了三倍, 并且維持了3'→5'校對(duì)活性, 故而既能快又能準(zhǔn)。
況且它的緩沖液配方已然進(jìn)行了優(yōu)化, Mg2+的濃度以及pH值均歷經(jīng)精準(zhǔn)調(diào)試, 致使酶于最優(yōu)條件之下開(kāi)展工作。老張進(jìn)行了一番計(jì)算: 以往一天僅僅能夠開(kāi)展三輪實(shí)驗(yàn), 現(xiàn)今在相同的時(shí)長(zhǎng)內(nèi)能夠進(jìn)行八輪, 直接把引物的篩選周期由兩個(gè)月縮減至兩周。項(xiàng)目的進(jìn)度瞬間得到提升, 領(lǐng)導(dǎo)在會(huì)議上還特意對(duì)他予以了表?yè)P(yáng)。
2025年元旦過(guò)后, 老張的項(xiàng)目按照預(yù)期完成了初步驗(yàn)證, 之后將樣本送到第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu), 檢測(cè)結(jié)果全部合格, 他特意給我發(fā)了條微信: “兄弟, 倘若你認(rèn)識(shí)從事分子診斷研發(fā)的朋友, 務(wù)必要推薦他們?nèi)ピ囋囇笢?zhǔn)生物的快速PCR擴(kuò)增試劑盒?！?。
實(shí)驗(yàn)室里的日常，不再是等機(jī)器響
如今老張所在的實(shí)驗(yàn)室處, 那款快速PCR擴(kuò)增試劑盒已然成為了標(biāo)配試劑。并非僅是他自身使用, 團(tuán)隊(duì)里的其他幾位同事也用上了。以往大家開(kāi)展實(shí)驗(yàn)時(shí), 常常需要預(yù)先進(jìn)行排班。因?yàn)橐慌_(tái)PCR儀一次僅能跑一輪, 一輪需耗時(shí)一個(gè)多小時(shí)。幾個(gè)人排隊(duì)等候機(jī)器乃是常態(tài)。如今情況好轉(zhuǎn), 22分鐘即可完成一輪, 一個(gè)人中午吃完飯回來(lái)便能收集數(shù)據(jù), 下午還能夠再跑兩輪。
老張講了個(gè)情況, 那就是他現(xiàn)如今的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣給改變了。以往做梯度PCR去優(yōu)化退火溫度的時(shí)候, 那可得設(shè)置十二個(gè)溫度梯度才行, 跑上一回差不多得快來(lái)兩個(gè)小時(shí)的時(shí)間?，F(xiàn)今他使用快速PCR擴(kuò)增試劑盒咧, 在這樣相同的梯度條件下, 僅僅只需要二十幾分鐘就可以完成咧, 并且, 其溫度分辨率是更加高的, 能夠找到最佳退火溫度的速度比以前快了一倍更多不止。
我仍記得, 老張?jiān)幸换厥惆l(fā)感慨, 稱這款試劑盒所改變的, 并非僅僅是實(shí)驗(yàn)效率, 更是整個(gè)團(tuán)隊(duì)的信心。以往, 每當(dāng)項(xiàng)目處于緊張狀態(tài)時(shí), 大家便會(huì)懼怕PCR出現(xiàn)問(wèn)題, 究其原因, 在于補(bǔ)做一輪會(huì)耗費(fèi)過(guò)多時(shí)間。如今則全然不同, 就算大不了加點(diǎn)班再多跑幾輪, 畢竟一輪僅需二十幾分鐘, 心態(tài)已然全然不相同了。
總結(jié)：選對(duì)PCR擴(kuò)增試劑盒，實(shí)驗(yàn)效率翻倍
老王的過(guò)往實(shí)際上包含著一定的典型意義。不少?gòu)氖路肿釉\斷研究開(kāi)發(fā)的友人, 每日都與PCR有所關(guān)聯(lián), 然而對(duì)于快速PCR擴(kuò)增試劑盒的認(rèn)知僅僅停留在“速度夠快便可”的數(shù)據(jù)范疇里面。事實(shí)上, 真正質(zhì)量上乘的快速試劑盒, 其內(nèi)涵乃為酶工程、緩沖液化學(xué)以及熱循環(huán)算法的全方位優(yōu)化。它不但要具備快速的特性, 還得擁有穩(wěn)定的表現(xiàn), 并且需要達(dá)成精準(zhǔn)的成效。
要是你跟老張的情況相同, 因PCR擴(kuò)增的速度致使項(xiàng)目進(jìn)度受到了拖累, 那不妨去對(duì)迅準(zhǔn)生物的產(chǎn)品做一番了解。可別輕視這一輪能提升二十幾分鐘速度的情況, 把它置于整個(gè)完整的研發(fā)項(xiàng)目周期之中, 最后節(jié)省下來(lái)的時(shí)間是以月作為計(jì)算單位的。
實(shí)驗(yàn)做得順不順，很多時(shí)候就差一個(gè)好的工具。
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