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從事分子實(shí)驗(yàn)的人都清楚, PCR 純化這一流程, 表面瞧著簡(jiǎn)易, 實(shí)則是決斷整個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的核心要點(diǎn)。好多人耗費(fèi)高額資金購(gòu)置了試劑盒, 然而結(jié)果卻是回收率欠佳、純度糟糕, 甚至對(duì)后續(xù)的酶切、連接以及測(cè)序都產(chǎn)生了影響。我這篇文章不會(huì)講些空洞話語(yǔ)，而是僅僅講述我友人老張的實(shí)際經(jīng)歷。他歷經(jīng)從陷入困境到尋覓到可靠方法的蛻變, 一步一腳印走來(lái)所積累的經(jīng)驗(yàn), 對(duì)于每一位正在進(jìn)行 PCR 純化操作的你都會(huì)造就直接的助力。
老張的實(shí)驗(yàn)室困境
某生物公司研發(fā)部的小組長(zhǎng)是老張, 他至今已從事這一行業(yè)時(shí)長(zhǎng)超過(guò)五年。他們所在的團(tuán)隊(duì)主要負(fù)責(zé)開展基因檢測(cè)產(chǎn)品的開發(fā)工作, 每日與PCR產(chǎn)物頻繁接觸并非稀奇之事。在2025年3月之時(shí), 他們承接了一個(gè)緊急項(xiàng)目, 此項(xiàng)目要求在兩周時(shí)間內(nèi)完成一批樣品的高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建。
項(xiàng)目剛開始, 就出現(xiàn)了問(wèn)題。老張帶領(lǐng)組員使用之前一直使用的這款PCR純化試劑盒, 然而連續(xù)三次回收率都未達(dá)到60%。測(cè)序數(shù)據(jù)出來(lái)后, 查看質(zhì)量, 更是糟糕透頂, 許多片段長(zhǎng)度不對(duì), GC含量偏差大。老張當(dāng)時(shí)發(fā)怒了, 拍著桌子質(zhì)問(wèn)道: “這試劑盒究竟還能否使用? ”。
為什么PCR純化這么重要
PCR純化遠(yuǎn)超單純的產(chǎn)物回收范疇, 它需去除引物二聚體這般的雜質(zhì), 還要去除未結(jié)合的dNTP這類雜質(zhì), 也要去除聚合酶是一種雜質(zhì), 以及鹽離子同樣屬于雜質(zhì)；與此同時(shí), 它必須擔(dān)保目標(biāo)片段的完整性, 并且要確保目標(biāo)片段擁有高回收率。要是純化未達(dá)干凈程度, 后續(xù)的限制性內(nèi)切就會(huì)出現(xiàn)切不開的狀況, 連接效率也會(huì)變得低下, 轉(zhuǎn)化還會(huì)失敗, 如此一來(lái)整個(gè)實(shí)驗(yàn)都不得不重新開展。
老張后來(lái)跟我喝酒之際發(fā)出感慨, 他講, 我先前認(rèn)為PCR純化等同于一個(gè)洗菜的流程, 隨意清洗一番便可以了, 然而過(guò)后才明白, 洗菜這件事還得考量使用何種水, 以及運(yùn)用怎樣的方式去清洗, 要是清洗達(dá)不到要求, 菜就會(huì)壞掉。
PCR純化試劑盒應(yīng)該怎么選擇
回收率是硬指標(biāo)
在老張踩坑以后, 就開始特別用心地去研究那一眾市場(chǎng)上占據(jù)主導(dǎo)地位的PCR純化試劑盒了。他最先密切留意的便是回收率這一指標(biāo)。他還跟我講說(shuō): “要是回收率低于70%的話, 那就直接不予考慮。咱們目前所做的是關(guān)于小片段回收方面的事兒, 處于100bp到500bp之間這樣一個(gè)范圍內(nèi)的那些片段可是最容易出現(xiàn)丟失情況的, 所以務(wù)必要挑選專門針對(duì)這個(gè)特定范圍精心優(yōu)化過(guò)的產(chǎn)品才行。”。
他查閱了諸多文獻(xiàn), 他發(fā)覺(jué)優(yōu)良的PCR純化試劑盒, 對(duì)于100bp以上片段的回收率能夠達(dá)到85%以上, 并且對(duì)于引物二聚體此類小于50bp的雜質(zhì), 去除效率要大于95%。這乃是最基礎(chǔ)的門檻。
操作流程影響效率
老張所在那團(tuán)隊(duì), 每日都得處理幾十個(gè)樣品, 操作步驟增多之后, 不但累人, 而且極易出錯(cuò)。他相當(dāng)看重試劑盒操作是否簡(jiǎn)便。就像磁珠法, 雖說(shuō)回收率高, 然而卻需要額外的磁力架以及多次洗滌的步驟；柱離心法, 要是設(shè)計(jì)得不錯(cuò), 兩三步便能夠完成。
老張將幾款產(chǎn)品做了對(duì)比, 發(fā)覺(jué)有的試劑盒要添加結(jié)合液, 還要添加洗脫液, 并且還要進(jìn)行加熱孵育, 這一整套流程下來(lái)得四十分鐘；而有的僅僅只需添加磁珠, 經(jīng)過(guò)結(jié)合、洗脫這三個(gè)步驟, 二十分鐘便能夠完成。對(duì)于高通量項(xiàng)目而言, 時(shí)間就是成本。
純度和后續(xù)兼容性
讓老張?jiān)庥龅阶畲罄_的, 便是純度方面的問(wèn)題。在之前的那款試劑盒里回收而得的產(chǎn)物, 其A260與A280的比值常常處在低于1.8的狀態(tài), 這表明存在著蛋白質(zhì)或者酚類的污染情況。像這樣的產(chǎn)物去進(jìn)行酶切反應(yīng), 其效率將會(huì)直接下降一半。
他另外發(fā)覺(jué), 存在這樣的情況, 有的PCR純化試劑盒, 即便是回收率較高的情形下, 然而其殘留的鹽離子竟然會(huì)對(duì)下游進(jìn)行的熒光定量PCR產(chǎn)生影響, 從而致使Ct值呈現(xiàn)偏高的狀況。所以在進(jìn)行選擇之際，必須要查看它是不是與后續(xù)開展的酶切、連接以及測(cè)序等應(yīng)用相互兼容。最好是存在廠家所提供的數(shù)據(jù)或者文獻(xiàn)能夠起到支撐。
一次轉(zhuǎn)機(jī)：老張的親身測(cè)試
在2025年5月的時(shí)候, 老張獲朋友做的推薦, 然后去試用一款全新的PCR純化試劑盒, 起初他處于半信半疑的狀態(tài), 畢竟之前遭受過(guò)被坑的情況, 隨后, 他拿標(biāo)準(zhǔn)品開展了三批小試。
第一批, 是回收五百bp的片段, 對(duì)此他使用那款試劑盒做了重復(fù)六次的測(cè)試, 其回收率分別為百分之八十六、百分之八十八、百分之八十五、百分之八十七、百分之八十六、百分之八十九, 平均為百分之八十七點(diǎn)五。第二批, 是回收一百五十bp的短片段, 其回收率也穩(wěn)定在百分之八十二以上。第三批, 是混有大量引物二聚體的樣品, 純化后引物二聚體的殘留量相較于之前所使用的試劑盒低了三個(gè)數(shù)量級(jí)。
當(dāng)時(shí)老張就有那么點(diǎn)兒激動(dòng)起來(lái)了, 然而他還是沉著冷靜地去做了后續(xù)的驗(yàn)證工作。他把經(jīng)過(guò)了純化處理之后的產(chǎn)物給拿著去做酶切以及連接方面的實(shí)驗(yàn)了, 酶切的效率從之前而言的百分之四十提升到了百分之八十五的程度, 連接的效率也在百分之七十以上穩(wěn)穩(wěn)當(dāng)當(dāng)?shù)?。而后又拿著那些產(chǎn)物去做測(cè)序了, 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量中Q30的比例從百分之七十五提高到了百分之九十二的情況。
老張后來(lái)在團(tuán)隊(duì)例會(huì)上說(shuō), 那一刻他才明白, 一個(gè)能改變整個(gè)實(shí)驗(yàn)走向的好的PCR純化試劑盒, 確實(shí)存在。
實(shí)戰(zhàn)應(yīng)用中的心得
那個(gè)從2025年6月起始的時(shí)間點(diǎn)開始后, 老張所在的整個(gè)團(tuán)隊(duì)正式地?fù)Q上了這款PCR純化試劑盒, 直至如今歷經(jīng)了差不多一年的時(shí)長(zhǎng), 他歸納總結(jié)出了幾點(diǎn)在實(shí)際操作過(guò)程中的心得體會(huì)。
需將樣品上樣量把控于試劑盒所建議的范圍之內(nèi), 有部分同事因貪圖省事, 一次添加過(guò)多樣品, 致使結(jié)合未達(dá)充分程度, 結(jié)果回收率反倒下降, 老張規(guī)定每人每次上樣量不得超過(guò)5μg總DNA。
洗脫的所需時(shí)間必須要足夠, 有的部分試劑盒明確規(guī)定洗脫液在膜上停留的時(shí)長(zhǎng)為兩分鐘, 當(dāng)中有人因迫切著急趕時(shí)間, 致使停留時(shí)間僅達(dá)到30秒, 最終造成回收率下降了一成, 老張?zhí)匾庠趯?shí)驗(yàn)臺(tái)的前面粘貼了一張?zhí)嵝训募垙垺?/p>
不同的片段長(zhǎng)度, 需采用不同的洗脫體積。具體情況是, 老張經(jīng)過(guò)觀察發(fā)現(xiàn), 對(duì)于回收短的片段而言, 運(yùn)用更小的洗脫體積來(lái)進(jìn)行回收工作, 比如20μL, 這樣做能夠顯著地提高濃度；而對(duì)于回收長(zhǎng)的片段, 可采用30μL及以上的洗脫體積極來(lái)進(jìn)行回收, 以此保證回收率。
團(tuán)隊(duì)的整體提升
老張團(tuán)隊(duì)換了PCR純化試劑盒后, 其實(shí)驗(yàn)效率顯著增長(zhǎng)了, 以往構(gòu)建一個(gè)文庫(kù)時(shí), 單一的純化步驟就得耗費(fèi)一個(gè)多小時(shí)的時(shí)長(zhǎng), 然而如今僅半小時(shí)便能夠完成此項(xiàng)操作。更為關(guān)鍵的是, 實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性已然得到改善, 過(guò)去針對(duì)相同的樣品, 不同人員所做實(shí)驗(yàn)得出的回收率最高能相差20%, 但現(xiàn)在基本穩(wěn)定于5%以內(nèi)。
老張跟我說(shuō), 做科研懼怕的就是結(jié)果不存在穩(wěn)定性, 你耗費(fèi)大量時(shí)間得出一組數(shù)據(jù), 然而下一次卻無(wú)法復(fù)制出來(lái), 這誰(shuí)能夠承受呢, 一個(gè)優(yōu)質(zhì)的試劑盒, 起碼能讓我于純化這個(gè)環(huán)節(jié)不再憂心忡忡。
今年3月, 他們的團(tuán)隊(duì)完成了一個(gè)大型測(cè)序項(xiàng)目，該項(xiàng)目的樣本量超過(guò)了2000個(gè), 在整個(gè)過(guò)程當(dāng)中都沒(méi)有曾只因純化問(wèn)題而進(jìn)行返工過(guò), 老張于項(xiàng)目總結(jié)會(huì)其間特地表?yè)P(yáng)了組員們挑選試劑盒的眼光。
寫在最后
講完了老張的故事, 然而我認(rèn)為, 對(duì)于許多從事做實(shí)驗(yàn)的人來(lái)講, 他的經(jīng)歷恰似一面鏡子。PCR純化屬于分子實(shí)驗(yàn)里最為基礎(chǔ)的步驟, 不過(guò)它也是最易于被忽略的環(huán)節(jié)。好多人覺(jué)得“反正無(wú)非就是洗一洗罷了, 使用什么都大致一樣”, 結(jié)果在不顯眼的地方摔了跟頭。
挑選一款正確的PCR純化試劑盒, 并非只是簡(jiǎn)單購(gòu)買一個(gè)物品, 而是為整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程增添一份保障?；厥章侍幱谳^高水平、純度頗高、操作具備便利特性、兼容性良好, 記住了這幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，下次在進(jìn)行選擇之時(shí)就不會(huì)再度陷入困境中了。
老張如今碰到任何人都會(huì)去推薦自己正在使用的那款試劑盒, 不過(guò)我心里明白, 其所更想表述的乃是, 無(wú)論運(yùn)用何種工具, 嚴(yán)謹(jǐn)且細(xì)致地對(duì)待每一個(gè)實(shí)驗(yàn)所處階段, 這才是從事科研工作之人應(yīng)盡的本分。
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