就在上個月, 老林是在實驗室里不停地抓耳撓腮著, 他手里拿著的電泳圖, 怎么看都覺著不太對勁。他一直盯著那條模糊得不清楚的條帶, 眉頭緊緊地鎖著。關(guān)于PCR產(chǎn)物純化這件事情, 他已經(jīng)反復折騰了好幾回, 每一回都覺得是試劑盒出現(xiàn)了問題。然而就算換了兩三個不同的牌子, 效果卻依舊是不穩(wěn)定的, 甚至有一回純化完之后, 連目標條帶都找尋不到了。他忍不住向我抱怨說：“這PCR純化試劑盒究竟該怎么去選擇呀? 難道是我自己的運氣實在太差了嗎? ”。
從大學時期的研究小組開始, 我與他相識已將近十年, 到如今各自于生物公司負責研發(fā), 我們針對實驗里的那些坑交流頗多。老林這人做事特別較真, 實驗步驟從來都不馬虎, 然而恰恰是因如此, 他在發(fā)現(xiàn)問題時會更加焦慮。他跟我講, 每次進行PCR純化時, 他都會嚴格依照說明書去操作, 離心時間以及洗脫體積均精確到微升, 可結(jié)果只是有時候好有時又不好。特別是在2024年的秋天, 他于上海青浦的一家第三方檢測公司開展項目, 存在需要對一批樣品進行批量處理的情況, 然而其結(jié)果卻是連續(xù)三天純化回收率均低于40%, 這使得后續(xù)的測序?qū)嶒灍o法得以推進, 進而導致項目險些延期。
這事兒使我回想起自身早些年的體驗, 那時我初次接手一個高通量測序的項目, 每日要處理上百份樣本, PCR純化這個環(huán)節(jié)困擾了我足足兩周, 我嘗試過不同品牌的試劑盒, 也向行業(yè)里的老手請教過, 最終才逐漸摸索出一些方法, 之后我把經(jīng)驗分享給老林, 他依照著調(diào)整了幾個細節(jié), 問題頓時迎刃而解, 如今, 他不但自己使用得得心應(yīng)手, 還為團隊優(yōu)化了流程, 回收率穩(wěn)定在85%以上。我要把老林的踩坑經(jīng)歷與我這幾年所得的心得合在一起寫個出來, 就針對這篇文章, 期望能夠幫你少走些彎路。
PCR純化試劑盒的核心作用到底是什么
許多人一旦拿到PCR純化試劑盒, 便趕忙依照說明書著手操作, 然而卻忽視了其最為根本的邏輯。老林起初所犯的亦是這個錯誤。他覺得只要將產(chǎn)物過一下柱子, 把雜質(zhì)除掉、讓DNA留存下來便可以了。但實際上, PCR純化試劑盒的核心作用涵蓋三個方面: 去除引物二聚體, 去除多余的dNTP和酶, 以及有效地回收目標片段。
2025年初, 老林于杭州濱江的一家生物技術(shù)公司擔任顧問, 為其優(yōu)化某種病原體檢測的方案, 那時他們使用某進口品牌試劑盒并在純化后開展qPCR, 卻老是出現(xiàn)非特異性擴增情況, 老林經(jīng)由細致逐一排查引物設(shè)計, 以及退火溫度等方面, 均未能找出問題所在, 而后他運用純化產(chǎn)物再次進行高分辨率瓊脂糖電泳測試, 卻意外覺察引物二聚體壓根未曾被去除, 至此他才真正明晰, PCR純化試劑盒的磁珠所產(chǎn)生的或膜所呈現(xiàn)的對短片段的選擇性吸附, 乃是決定純化質(zhì)量的最為關(guān)鍵的因素。打從那之后, 他每一回挑選試劑盒時, 都會首先去查看其針對于像五十堿基對以下這類短片段的去除本領(lǐng)。
怎么判斷PCR純化試劑盒好不好
老林后來歸納出了一套判定標準, 按他的說法, 便是“瞧三樣事物”: 回收效率, 純度, 以及操作時間。他曾跟我說起2024年冬季于南京舉辦一次行業(yè)交流會上的一樁事。那時他剛換了一款新牌子的試劑盒, 在現(xiàn)場拿自己的樣本做了測試, 其回收率能夠達成95%, 并且洗脫后A260/280比值處于1.8至2.0之間, 相當出色。然而真正使他下定決心長期采用的, 卻是操作時間。那款試劑盒的流程僅需15分鐘, 而先前的牌子則要30分鐘以上。老林屬于每天都得處理幾十個樣本的人, 對其一而言, 省下的時間那可是實實在在的效率。
但是, 他告誡我, 絕不能僅僅去看參數(shù)。有一部分試劑盒的回收率挺高, 然而洗脫下來的 DNA 降解速度特別快, 放置一個晚上之后再去跑電泳, 條帶就會變淺變淡。在 2025 年的 6 月, 老林于北京中關(guān)村的一個合作實驗室開展了對比測試, 他把同一批 PCR 產(chǎn)物分別拿四種試劑盒進行純化, 接著存放在 4℃歷經(jīng) 48 小時之后再跑電泳, 有兩個牌子的條帶已然模糊不清, 而另外一個他后續(xù)長期使用的牌子, 條帶依舊相當清晰。這表明試劑盒的穩(wěn)定性以及保護劑配方同樣是很重要的。
每次純化結(jié)果不穩(wěn)定怎么辦
這是老林, 踩得最深的, 一個坑。2024年秋天, 他才剛換新試劑盒, 連續(xù)一周, 純化結(jié)果不都穩(wěn)定, 有時候, 回收率70% , 有時候, 突然掉到30%。他一度懷疑, 是樣品出了問題, 但同一批樣品, 拿舊的試劑盒做, 結(jié)果卻很穩(wěn)定。他檢查了所有步驟, 最后發(fā)現(xiàn), 是操作中, 離心時間不一致, 導致的。
曾經(jīng), 他于2025年初的一回內(nèi)部培訓里特意分享過這般教訓, PCR純化試劑盒的說明書所注明的“離心1分鐘”, 眾多人往往會隨意按個30秒便取出。但是, 不同品牌的試劑盒對于離心力的要求存在差異, 有些需達12000g, 而常規(guī)臺式離心機若不預(yù)熱, 實際轉(zhuǎn)速極有可能達不到。老林的解決方式是, 每次操作之前用轉(zhuǎn)速計校準離心機, 并且嚴格把控計時。他還在實驗室張貼了一張便簽, 寫著“PCR純化, 離心1分鐘, 一秒不少?！??！睆哪且院?，他的結(jié)果再也沒有出現(xiàn)過大的波動。
選磁珠法還是柱膜法
面臨有關(guān)那個問題, 老林近半年都處于糾結(jié)狀態(tài)中。2024 年夏天時, 那種狀態(tài)的他在廣州參與了一個高通量測序培訓班, 培訓期間講師詳盡地講述了兩種方法各自的優(yōu)點與缺點。磁珠法這一方法適宜進行自動化操作, 對于大規(guī)模樣本的處理相對友好, 然而面臨磁珠這一情況, 其質(zhì)量存在不一致的狀況, 要是磁珠呈現(xiàn)分散不均勻的情形, 那么回收率就將相應(yīng)地出現(xiàn)降低的情況。柱膜法這種方法操作具備直觀性特點進而適合小批量處理, 可是它存在洗脫體積固定的狀況, 一旦樣本濃度低的話, 就容易被稀釋。
老林, 于最后時刻, 自行做出了磁珠法的選擇, 緣由在于, 他所身處的團隊, 自2025年年初起始, 便著手引入自動化工作站。他曾與我表露, 磁珠法PCR純化試劑盒的關(guān)鍵之處, 在于磁珠的粒徑以及表面修飾情況。他針對多款國產(chǎn)磁珠試劑盒加以試用, 當中存在一些磁珠, 沉降速度過快現(xiàn)象, 于上機之后, 尚未實現(xiàn)完全吸附, 便已然沉至底部。后續(xù), 他挑選了一款磁珠, 其粒徑處于1微米左右, 并且表面帶有羧基基團, 該磁珠吸附效率具備穩(wěn)定性, 與此同時, 在洗脫之后, DNA完整性表現(xiàn)良好。他們團隊, 在2025年3月, 運用這套方案, 完成了有300份樣本的臨床驗證項目, 純化之后的產(chǎn)物在完成該項目時, 直接被用于NGS建庫, 最終結(jié)果全部合格。
如何避免PCR產(chǎn)物在純化中丟失
老林往昔最怕的便是純化完后發(fā)覺產(chǎn)物沒影了, 如此情形, 通常存在三個緣由, 一是結(jié)合條件有誤, 二是洗脫體積過小, 三是吸附材料過載, 2024年12月, 老林于深圳的一間朋友公司協(xié)助調(diào)試一個試劑盒, 他們所用的樣本濃度超高, PCR產(chǎn)物總量超出10微克, 然而試劑盒標稱的最大結(jié)合量僅為5微克, 結(jié)果純化完畢, 大部分產(chǎn)物都流穿了, 老林隨后建議他們先采用Qubit定量, 接著依據(jù)試劑盒的載量上限分次予以處理, 問題便得以解決了。
他提及方面細致點: 化合著緩沖液pH數(shù)值以及鹽濃度情況。部分PCR純化使用物對于化合環(huán)境具備敏感性, 要是PCR產(chǎn)物當中殘留鹽分程度過度高, 會產(chǎn)生競爭結(jié)合位置現(xiàn)象, 致使回收比率降低情況。老林慣常做法是, 純化之前憑借瓊脂糖電泳查看一回PCR產(chǎn)物數(shù)量與質(zhì)量狀況, 要是察覺產(chǎn)物里雜質(zhì)較多, 他會先借助乙醇沉淀粗略純化一回, 接著才進行試劑盒運作流程。增添這一步驟之后, 他回收比率從未有低于80%情況。
長時間不用的試劑盒還能用嗎
今年5月，老林把一個放了半年的PCR純化試劑盒找了出來, 想要嘗試看看是否還能夠使用。他依照說明書進行了一次操作, 結(jié)果回收率僅僅只有50%, 并且洗脫液之中存在肉眼可看到的沉淀。他撥通電話詢問廠家技術(shù)人員, 所得到的答復是試劑盒里的磁珠或者酶在長時間儲存之后可能會失活, 特別是當保存溫度不穩(wěn)定之時, 問題就會更加顯著。
往后他擬訂了一項規(guī)則, 試劑盒開啟封蓋之后, 要記錄日期, 要是超出三個月尚未用完的, 便直接予以報廢處理。在2025年4月的時候，他將實驗室里全部過期的試劑盒, 進行了一番清理, 更換了一批全新的。他運用新試劑盒所做的首批樣品, 回收率徑直達到了90%以上。他對我講, PCR純化試劑盒并非是越低廉就越優(yōu)質(zhì)佳善之選項, 也不是倉儲囤貨數(shù)量越多就會越具劃算之特點, 依據(jù)實際需求來進行采購, 隨其使用之時隨時購置此等試劑盒, 才是最為省心省力而又簡便易行之又佳之又優(yōu)的做法。
老林如今已然是團隊里大家都認可的PCR純化方面的“老法師”了, 每當有新人去詢問他該怎樣挑選試劑盒時 , 他都會率先詢問一句: 你所處理的是怎樣的樣本? 存有多少量? 后續(xù)要開展什么實驗? 他講 , 不存在完美的試劑盒 , 僅有最適配你流程的 , 他曾經(jīng)踩過的那些坑 , 在踩過去以后 , 反倒成了他最為珍貴的經(jīng)驗。
