這是一篇能幫你省下三個月時間的經(jīng)驗分享
我在生物公司做研發(fā)時結(jié)識的哥們是老張, 他做了快十年的細(xì)胞培養(yǎng), 在技術(shù)方面肯定算得上老手。然而今年年初, 他差點因“細(xì)胞株”選錯這件事, 把自己手上的項目搞砸。今天我將他的這段經(jīng)歷寫出來, 期望正在做細(xì)胞實驗的你, 能少走些彎路。
為什么說細(xì)胞株是實驗的“地基”
當(dāng)時, 老張承接了一個新項目, 該項目要求在三個月內(nèi)完成一批關(guān)鍵的功能驗證實驗。他依照老經(jīng)驗, 直接于液氮罐里復(fù)蘇了一株先前用過的細(xì)胞株, 心里想著“這東西我熟悉, 肯定不會有問題”。
跑出來第一輪數(shù)據(jù), 其結(jié)果跟文獻(xiàn)里相比, 差的幅度處于整整一個數(shù)量級。他沒完沒了地查了試劑、查了培養(yǎng)條件、查了操作手法, 結(jié)果都毫無問題。最終, 他把帶著懷疑的目光投在了那株他使用了多年的細(xì)胞株之上。
稍后他才察覺到, 細(xì)胞株這類事物, 恰似蓋樓時打下的根基那般。你所蓋樓房多么精美, 然而地基若是歪斜, 一切均為徒勞。對于從事生物實驗的人員來講, 細(xì)胞株便是處于最底層的那個“一號位”。其來源、傳代的次數(shù)、是否遭受污染, 直接對之后所有實驗數(shù)據(jù)的可信度起到?jīng)Q定作用。
選細(xì)胞株前，必須先搞清楚來源
那次老張遭遇踩坑情況, 最為關(guān)鍵核心的問題, 恰恰是出在了“來源”這個方面。他所使用的那株細(xì)胞, 是經(jīng)由從幾年之前的隔壁實驗室那里“借”過來的, 在這中間它究竟傳了多少代, 并且有沒有做過相關(guān)鑒定, 對于此每件誰都沒辦法說得清。
那之后, 他在跟我回顧細(xì)節(jié)時講, 當(dāng)下已察覺是細(xì)胞株身份出現(xiàn)了混淆狀況, 甚而存在交叉感染其他細(xì)胞的可能性那一段時間, 他每日都沉浸于培養(yǎng)間, 望著經(jīng)顯微鏡觀察確認(rèn)為生長態(tài)勢良好的細(xì)胞, 內(nèi)心卻始終忐忑不安: 這些細(xì)胞究竟是不是如自己所認(rèn)為的那般呢?
所以, 選細(xì)胞株時首要之原則, 乃是弄明白它的來源路徑?；蛘邚木哂泄帕Φ募?xì)胞庫予以購置, 或者自行再度開展STR鑒定。千萬不要為求簡便, 而采用那些來源朦朧、傳代次數(shù)已然無法確切明晰記得的“祖?zhèn)鳌奔?xì)胞。
傳代次數(shù)和穩(wěn)定性，決定了你能走多遠(yuǎn)
當(dāng)老張著手再次去挑選細(xì)胞株之際, 又碰到了一個全新的問題, 那便是究竟是要做出選擇低代次的決定, 還是做出選擇高代次的決定?
之初, 他覺著, 只要細(xì)胞可生長, 代數(shù)高些許或者低些許并無所謂。而后, 他選取了一株已然傳至三十多代的細(xì)胞去開展實驗, 發(fā)覺細(xì)胞狀態(tài)顯著變差, 生長速度亦是忽快忽慢, 關(guān)鍵在于, 一些關(guān)鍵的蛋白表達(dá)量, 相較于文獻(xiàn)而言低了許多。
他這才領(lǐng)悟到, 細(xì)胞株所謂的“代次”, 實際就是它壽命的衡量尺度。傳代的次數(shù)要是越高, 那么細(xì)胞產(chǎn)生基因突變以及發(fā)生表型漂移的可能性就越大。你費盡心力所做出的實驗, 很有可能僅僅是由于細(xì)胞自身“年邁”了, 就致使得出全然相悖的結(jié)論。
現(xiàn)今他所養(yǎng)成的習(xí)慣為, 對于所有新抵達(dá)的細(xì)胞株來說, 前五到十代的時候要先大量擴(kuò)增出一批并將其凍存起來, 而展開實驗僅使用十到二十代以內(nèi)的細(xì)胞, 一旦超出這個范圍, 無論有多便利, 都要毅然決斷地扔掉它們, 并重新進(jìn)行復(fù)蘇。
污染檢測和細(xì)胞鑒定，是必須做的“體檢”
這件事上老張曾遭受極大損失, 因而往后變得格外審慎。有一回, 他險些被一株貌似“長勢良好”的細(xì)胞株給蒙騙了。
那時他才剛獲取到一株全新的細(xì)胞, 憑借肉眼去觀察, 培養(yǎng)液呈現(xiàn)出清澈透明的狀態(tài), 在顯微鏡下查看, 細(xì)胞的形態(tài)同樣是正常的。他心里想著, 大概不會有問題, 于是就徑直開展了實驗。然而, 進(jìn)行了三次Western Blot實驗后, 條帶所處的位置卻始終無法對上。最終, 他使用支原體檢測試劑盒進(jìn)行檢查, 哎呀, 居然支原體顯示為陽性。
他講, 支原體形成的污染是極為坑騙人的那種, 緣由在于它并非將細(xì)胞給養(yǎng)到死亡的地步, 僅僅是悄然無聲地去改變細(xì)胞的代謝狀況以及基因表達(dá)情況罷了。你根本就察覺不到細(xì)胞已然死亡, 然而實驗所獲取的結(jié)果卻就是呈現(xiàn)出不對勁的情形。
于是當(dāng)下他為自己定下了一條絕無更改余地的規(guī)矩: 每一批次新復(fù)蘇的細(xì)胞株, 在投入使用之前都必定要完成三件事情, 分別是支原體檢測, 細(xì)菌真菌檢測, STR鑒定。這三件事情若未全部完成, 決然不會將其用于正式實驗。
培養(yǎng)條件和操作規(guī)范，決定實驗成敗
成功解決了細(xì)胞株自身的來源以及純凈度方面的問題之后, 老張再次著手去琢磨培養(yǎng)條件。他察覺到, 針對同一株細(xì)胞而言，倘若更換了一個培養(yǎng)基品牌, 或者血清批號發(fā)生了改變, 那么其生長狀態(tài)均會出現(xiàn)不一樣的情形。
他特意耗費了兩周光陰? 將從培養(yǎng)基配制, 到消化時長, 再到接種密度, 直至孵育環(huán)境的每一項參數(shù)? 都再度予以優(yōu)化了一回。他跟我講, 諸多實驗新手認(rèn)為“細(xì)胞能生長便可”? 實則恰恰相反 , 細(xì)胞株唯有在最為適宜的狀況下 , 方可穩(wěn)定地展現(xiàn)你所需求的那些指標(biāo)。
他如今每獲取一株新細(xì)胞，都會第一時間去做一次全面的生長曲線測定, 以此來確定最為適宜的換液以及傳代時間點。此項工作盡管十分繁瑣, 然而一旦將其做好, 后續(xù)幾個月的實驗便都會順暢許多。
細(xì)胞株的“凍存與復(fù)蘇”是個技術(shù)活
過去, 老張針對凍存這一事情, 表現(xiàn)得相當(dāng)馬虎大意。他認(rèn)為只要把細(xì)胞投放至液氮之中, 這樣就可以算作完成了。然而, 在經(jīng)歷過此次的教訓(xùn)之后, 他才開始重視起來。
去年, 他在復(fù)蘇一批關(guān)鍵細(xì)胞株時, 有過一次這樣的情況, 發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇之后活率僅僅不到百分之五十。之后進(jìn)行核查 , 原來是凍存液的配方過期了, 再加上降溫速度未能把控好, 細(xì)胞在凍存過程當(dāng)中大量被冰晶刺破。
凍存的細(xì)胞, 他目前會嚴(yán)格依照“慢凍快融”的準(zhǔn)則。用到具有程序降落溫度功能的盒子來進(jìn)行凍存, 確保每一分鐘溫度下降的速度大概在1攝氏度上下。復(fù)蘇的時候則采用37度的水浴, 并且快速地?fù)u動, 盡可能在1分鐘之內(nèi)實現(xiàn)解凍。他講, 細(xì)胞株的凍存以及復(fù)蘇, 直接對每次實驗起始階段的質(zhì)量產(chǎn)生決定性作用, 這個環(huán)節(jié)若偷懶省事, 后續(xù)將會面臨諸多麻煩。
定期驗證和備份，是最后一道保險
最后階段時, 老張積累起一整套細(xì)胞株管理經(jīng)驗。他手頭每株重要細(xì)胞, 都在三個不同液氮罐里分別備份。每三個月, 他隨機(jī)抽查一管復(fù)蘇細(xì)胞做完整鑒定及功能檢測。
照著他所講的而言, 細(xì)胞株無疑是實驗者的“彈藥庫”。平常要是沒維護(hù)妥善, 等真正去到要面對實踐的時刻, 才發(fā)覺彈藥呈現(xiàn)出全是無法正常使用的狀況, 那時才曉得想哭卻沒有眼淚, 堪稱無奈至極。
他于今年三月份再度開啟了一個全新的項目, 此次僅僅花費尚未到一個半月的時間, 便將所有的預(yù)實驗數(shù)據(jù)全部完成了, 并且其結(jié)果呈現(xiàn)出穩(wěn)定且能夠重復(fù)的態(tài)勢。他聲稱, 這完全是由于在細(xì)胞株這個具體的環(huán)節(jié)之上, 他已經(jīng)預(yù)先把所有應(yīng)該踩的坑全部都踩過了。
祈愿老張的這段過往經(jīng)歷, 可使你于未來隨后開展的實驗里, 在“細(xì)胞株”這一事項之上, 一回便把眾多關(guān)聯(lián)之事妥善做對。畢竟呀, 實驗最為忌憚的并非是全然做不出結(jié)果來, 而是好不容易做出來結(jié)果了卻難以令人信賴靠譜。
